İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu
7 Ocak 2019
Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.
Bu yöntem, alandaki yaygın bir sorunu giderır ve hızlı izolasyon ve belirli ilgi belirteçleri ile tek hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu için tam bir iş akışı sağlar. Nanoparçacık izleme analizi yarı otomatik bir yöntemdir. Bu ekstrasellüler veziküllerin boyut dağılımını analiz etmek için ışık saçılma ve Brownhareketin özelliklerini kullanır.
Prosedürü gösteren Vera Schmidt, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi olacak. Hücre dışı vezikülleri izole etmek için, serum ayırıcı tüpler içine insan tam kan iki mililitre örnekleri topladıktan sonra, örnekler in oda sıcaklığında 15 dakika pıhtılaşmak için izin santrifüj ile serum hücreleri ayırmadan önce. Trombositleri çıkarmak için santrifüj için her örnekten bir mililitre serumu ayrı ayrı 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın ve trombosit-fakir plazmanın 100 mikrolitresini yeni 1,5 mililitrelik reaksiyon tüplerine aktarın.
Daha sonra, plazma ve girdap iyice örnekleri ekzozom çökelti 25 mikrolitre ekleyin. Buz üzerinde 30 dakikalık bir kuluçka dan sonra, santrifüj ile ekstrasellüler veziküller toplamak. Pelet bej veya beyaz renk olarak görünür.
Süpernatant aspire ve tekrar örnek santrifüj. Daha sonra, sıvı tüm translar çıkarın ve PBS 100 mikrolitre pelet resuspend. Veziküllerin hücre zarlarını boyamak için, yeni hazırlanmış PKH67 etanolik boya çözeltisi 50 mikrolitre EV süspansiyon 10 mikrolitre ekleyin ve iyice karıştırın.
Karanlıkta oda sıcaklığında beş dakika sonra, 15 mililitrelik konik bir tüp içinde 2,5 mililitre distile su ile lekeli ekstrasellüler vezikül süspansiyon 50 mikrolitre seyreltin, iyice karıştırma ile. Antikorlar ile veziküller etiketlemek için, seyreltmek 10-20 mikrolitre lekesiz ekstrasellüler vezikül süspansiyon ile 50 mikrolitre distile su 1.5 mililitre reaksiyon tüpü, iyice karıştırma ile. Karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakikalık bir kuluçka için, reaksiyon tüpüne ilgi antikor 2,5 ila beş mikrolitre ekleyin, iyice karıştırma ile.
Daha sonra, etiketli veziküllerin 50 mikrolitresini, tabloda belirtildiği gibi, uygun deneysel distile su hacmini içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Lekeli veya etiketli hücre dışı vezikülleri analiz etmeden önce, floresan filtresini önce mikroskop ve kameranın optik yoluna taşıyın ve otomatik uygulama için ekrandaki talimatları izleyerek programı başlatın. Hücre Denetimi sekmesinin altında, lazer ve mikroskopun ortak bir odak noktası olduğunu doğrulamak için floresan ölçümü için doğru Hücre Numarasını ve optik için referans konumunu seçin.
Hücre kanalını 10 mililitre distile suyla yıkamak için bir şırınga kullanın, ölçüm hücresinin hava kabarcıklarından arındırılmış olduğuna ve hava kabarcıklarının sisteme enjekte edilmemelerine dikkat edin. Daha sonra, 990 mikrolitre distile su damıtılmış su içinde 200 nanometre büyüklüğünde floresan etiketli polistiren parçacıkların 10 mikrolitre seyreltin ve 10 mililitre distile su içeren 15 mililitrelik bir tüp içine bu parçacık süspansiyon 10 mikrolitre ekleyin. Ardından, ilk seyreltilmiş parçacık çözeltisinin 2,5 mililitresini hücre kanalına enjekte edin ve kamerayı ayarlamak için Odak'ı Optimize Edin'e tıklayın.
Örneği ölçmek için hücre kanalını 10 mililitre distile suyla birden fazla kez temizleyin ve lekeli hücre dışı vezikül süspansiyonunu enjekte edin. Başvuru konumunu kullanarak, tabloda belirtildiği gibi Hücre Denetimi sekmesi altında uygun edinme parametrelerini ayarlayın. En uygun duyarlılık aralığını belirlemek için Parçacık Sayısı vs'yi tıklatın.
Duyarlılık, farklı duyarlılık düzeyleri için ekran başına ölçülen parçacıkların bir eğri görüntülemek için. Deklanşör parametresi için, kameranın ışığın belirli bir aralıkta geçmesini sağladığı süreyi ayarlayın. Postacquisition Parametreleri için en az 20 parlaklık, en az 20 nanometre boyutu ve maksimum ölçüm boyutu 500 nanometre'yi seçin.
Ekranın görüş alanında algılanan parçacıkların sayısına dikkat edin. Saçılma çubuğu yeşilden turuncuya, 50 ila 300 partikül aralığında olmalıdır. Sıfır Volt'ta Parçacık Drift'i Denetle'yi tıklatın ve Ölçüm sekmesini açın.
Video Edinmeyi Çalıştır'ı tıklatın ve Deneme Sayısını üç ila beşe, denemeler arasındaki Zaman Gecikmesini sıfır dakikaya ayarlayın. Parçacıkların analiz edildiği her ölçüm pozisyonunda tek tek alt hacim konumlarının sayısını 11'e ve ölçüm döngülerinin sayısını 10'a ayarlayın. Ardından, bir klasör seçin, yeni bir dosya adı oluşturun ve ölçümü başlatmak için Tamam'ı tıklatın.
Çözümlemenin sonunda, sonuçları gözden geçirmek için Çözümsekmesini açın. Daha sonra, konum başına düşen ortalama parçacık sayısını, izlenen parçacıkların toplam sayısını ve parçacık konsantrasyonunu, parçacıkların dağılım genişliğini ve ortalamanın değerini ve standart sapmayı kontrol edin. Ölçümün ayarlanması ve kalibrasyonu için floresan boncukların kullanılması optimum ayar hassasiyeti sağlar 85%Bu ayarları kullanarak, kamera keskin bir resim görüntüler ve tekrarlanan ölçümler düşük standart sapma gösterir.
Hücre zarının lipid bölgelerine uzun, alifatik kuyrukları içeren bir floresan hücre bağlayıcısı içeren bir hücre bağlayıcı kiti ile boyama, duyarlılık ve ölçülen parçacıkların sayısı arasında güçlü bir korelasyon ortaya koymaktadır. Ekstrasellüler vezikül lezülü nin bir proteine karşı antikor le boyanması, maksimum 541 nanometrelik maksimum büyüklüğü 220 ile 145 nanometre arasında bir parçacık dağılımını gösterir. Kontrol vezikülsüz suyun antikor lekesi sonrası ekstrasellüler vezikül tespit edilmez, %100'e yakın bir duyarlılığa kadar eğer sürüklenme saniyede 5 mikrometreden büyük olduğunda ölçüme başlanırsa, bireysel tekrarlar belirgin sapmalar gösterir.
Bu florofor hızlı fotobeyazrmaya yatkın olduğundan, florotiyosiyanatın florokrom olarak kullanılmasının yanlış ve tekrarlanamaz ölçümlerle sonuçlanması gerektiğini unutmayın. Bu protokol, belirli belirteçler kullanarak, tek hücre dışı veziküllerin hızlı bir karakterizasyonu için bu alandaki birçok araştırmacının önde gelen talebini giderır. Son on yılda yöntemlerönemli ölçüde iyileşmiş olmasına rağmen, tek hücre dışı veziküllerin analizi için henüz standart bir protokol bulunmamaktadır.
Hücre dışı vezikül biyolojisi üzerine yapılan araştırmaların gelecekteki ilerlemesine bakılmaksızın, bu yöntem belirli belirteçler kullanılarak tek hücre dışı veziküllerin karakterizasyonu için hızlı ve güvenilir bir protokol sağlar. Mevcut protokollerimiz uzun işlem süreleri veya emek yoğun adımlar içermediğinden, yüksek numune verime için de uygundur.
Genel Bakış
Bu protokol, insan tam kanından hücre dışı veziküllerin hızlı izolasyonu ve karakterizasyonu için eksiksiz bir iş akışını özetlemektedir. Yöntem, hücre kültür süpernatantları için yüksek tekrarlanabilirlik ve uyarlanabilirliği gösteren floresan tabanlı nanopartikül izleme analizini kullanarak spesifik belirteçleri değerlendirir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Hücre Biyolojisi
- Hücre Dışı Veziküller
Arka Plan
- Hücre dışı veziküller, hücreler arası iletişimin kritik bir rolünü oynamaktadır.
- Bu veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu, işlevlerini anlamak için gereklidir.
- Mevcut yöntemler verimlilik ve tekrarlanabilirlikten yoksun olabilir.
- Bu protokol bu zorlukları ele almayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- İnsan kanından hücre dışı veziküllerin izolasyonu için güvenilir bir yöntem sağlamak.
- Bu vezikülleri floresan tabanlı teknikler kullanarak karakterize etmek.
- Hücre dışı vezikül biyolojisine olan anlamayı artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- İnsan tam kan örneklerinin toplanması.
- Hücrelerin serumdan ayrılması için santrifüj kullanımı.
- Vezikül izolasyonu için ekzosom çökeltme solüsyonunun kullanılması.
- Karakterizasyon için floresan boyama ve nanopartikül izleme analizi.
Ana Sonuçlar
- Görünür bir pelet ile hücre dışı veziküllerin başarılı bir şekilde izole edilmesi.
- Karakterizasyon sonuçları, veziküllerin boyut aralığını ve spesifik belirteç varlığını göstermiştir.
- Çoklu deneylerde ölçümlerde yüksek tekrarlanabilirlik.
- Boyama ve parçacık algılama hassasiyeti arasında korelasyonun gösterilmesi.
Sonuçlar
- Protokol, hücre dışı vezikül analizi için sağlam bir yöntem sunar.
- Sonuçlar, yöntemin çeşitli örnek türleri için uyarlanabileceğini göstermektedir.
- Bu yaklaşım, hücre dışı vezikül biyolojisinde gelecekteki araştırmalar için potansiyeli artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Rapid fluorescence-based characterization of single extracellular vesicles (EVs) from human blood addresses a critical bottleneck in biomarker discovery and target validation workflows. By enabling reproducible, marker-specific analysis of EVs in clinically relevant fluids, the method supports early-stage mechanistic de-risking and improves predictive confidence in liquid biopsy applications. This capability enhances portfolio triage by providing quantitative, standardized data for go/no-go decisions in preclinical target programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through specific surface marker detection (e.g., CD63, CD9, vimentin, LAMP-1) on single EVs from human serum.
- Operational Value: Reduces mechanistic ambiguity by correlating fluorescence staining with particle detection sensitivity, supporting functional target validation.
- Predictive Value: High reproducibility across experiments, confirmed by orthogonal methods like Western blotting, increases confidence in early target selection.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantitative outputs including particle concentration, size distribution (220–1,145 nm), and mean/standard deviation metrics for downstream compound screening.
- Scalability: Semi-automated nanoparticle-tracking analysis with optimized acquisition parameters (e.g., 85% sensitivity, 20 nm minimum brightness) enables high sample throughput and platform reuse.
- Reproducibility: Consistent results across multiple experiments and sample types (serum, plasma, cell culture supernatants) support assay standardization in discovery pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Characterization of EVs from human blood provides a disease-relevant system for bridging discovery to preclinical validation.
- Risk-Adjusted Advancement: Reliable detection of specific markers (e.g., via antibody staining) enables biomarker-aligned decision-making in preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Avoids unreliable fluorophores (e.g., FITC) prone to photobleaching, ensuring data integrity for target mechanism studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for liquid biopsy and biomarker-driven programs.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling specific marker profiling of EVs isolated from human whole blood.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative EV characterization data (size, concentration, marker presence) for reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates traceable particle measurements, distribution width, and sensitivity curves that allow cross-condition comparison and hit validation.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of human-derived EVs and disease-relevant markers like vimentin and LAMP-1.
- Enterprise Reuse: Semi-automated workflow and adaptability to plasma, serum, and cell culture supernatants position the method as a scalable, reusable capability across teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through reproducible, marker-specific single EV analysis.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced hands-on time via semi-automated nanoparticle-tracking analysis.
- Strategic Value: Improved go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in biomarker programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on quantitative EV marker data from human blood samples.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence staining, nanoparticle-tracking analysis, and EV isolation techniques.
- Dependent on instrumentation capable of fluorescence detection, light-scattering measurement, and automated video acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of staining protocols (e.g., PKH67, antibody dilution) and acquisition parameters (sensitivity, shutter, subvolume positions).
- Adaptation considerations include adjusting antibody concentration (10–20 μL) and incubation time (30 min) for different markers across model systems.
- Practical limitation: Avoid fluorescein isothiocyanate (FITC) due to rapid photobleaching, which compromises measurement accuracy and reproducibility.
