Hasta Sare Retinasında Mikroglia Dinamikleri ve Sinapslarla Etkileşimlerin Canlı Görüntülemesi ve Karakterizasyonu

Laboratuvarımızın araştırma kapsamı, gelişim sırasında sinaps yeniden modellenmesinde glokom ve mikroglia'nın temel mekanizmalarını incelemektir. Mevcut deneysel zorluklar, mikrogliaların retinal ganglion hücre sinapslarını aktif olarak parçalayıp dağıtmadığı yoksa sadece pasif bir şekilde enkazı mı temizledikleri etrafında döner. Fare retinasını bir filtre kağıdına yerleştirerek laboratuvar mendiliyle kurutarak başlayın.

Retinayı MatTek Petri kabına ters çevirin. Retinayı metal boncuklar veya bir halka ile ağırlıklandırın. Sonra, üç ila beş damla yapay beyin omurilik sıvısı ekleyin.

Örneği dönen bir disk konfokal mikroskobunun altına yerleştirin ve retinayı önizlemek için ayarları ayarlayın. Z ekseni boyunca toplam 10 ila 20 mikrometre derinlikte 0,3 mikrometre basamak boyutuyla görüntüler toplayın. Güvenilir hücre takibi için çerçeveler arasındaki zaman aralığını 20 ila 30 saniye arasında tutun.

Mikroglia'nın yüzey render'ını gerçekleştirmek için, zaman geçişi dosyasını dosya dönüştürücü yazılımı kullanarak IMS formatına dönüştürün. Daha önce alınan görüntü özelliklerine göre voxel boyutlarını girin. Analiz yazılımı alanında, dönüştürülmüş dosyayı açmak için gözlem klasörüne tıklayın ve görüntünün 3D görünümde olduğundan emin olun.

Bireysel mikrogliaları tespit etmek için, nesne araç çubuğundaki yeni yüzey ekle simgesine tıklayın. Sadece ilgi alanını segment olarak seçin, yüzeyleri zaman içinde takip edin, yüzeyleri sınıflandırın ve algoritma ayarlarında nesne-nesne istatistiklerini sınıflandırın. Sonra, devam etmek için mavi oynat düğmesine tıklayın.

Yüzey render için kanalı seçin. İsteğe göre, yüzey yaratımı düzgünleştirmek ve yüzey detayını girmek için smooth etkinleştirin. Eşik altında hücreleri tespit etmek için makine öğrenimi segmentasyonunu seçin.

Eğitim verisi altında, arka plan ve ön plan fırça araçlarını kullanın. İstediğiniz fırçayı seçip shift plus sol tıklama tuşunu kullanarak fırça darbeleri çizin. Ekranı interpolasyon etkin olduğundan emin olun, sonra train ve predict seçin.

Z ekseni boyunca gezinmek için ortadaki sarı işareti kullanın. X, Y ve Z düzlemleri boyunca ve birkaç zaman diliminde birden fazla çizgi çizin. Her girişte üç ila beş kısa vuruş kullanın, doğru bir yüzey oluşturulana kadar yinelemeli olarak ayarlama yapın.

Sarı dikdörtgeni kullanarak eğitim ekranı ile son kontrol olarak oluşturulan gerçek yüzey arasında geçiş yapın. Ayrıca, yüzeyin hücre morfolojisiyle eşleşip örtüşmediğini kontrol edin. İş bittiğinde, bölünmüş nesneleri seçimden çıkarın.

Voxel histogram eşiğini ayarlayarak birincil yüzeyin parçası olmayan küçük, bağlantısız nesneleri kaldırın. Sonra, yüzeyi manuel olarak düzenleyerek gereksiz nesneleri veya kesilmiş kenarları makas aracıyla çıkarabilirsiniz. İstenilirse, nesne için izin verilen boşluk eşiği belirleyin ve hareket eden hücre için takip algoritmasını seçin.

Ana yüzeyle ilişkili olmayan nesneleri filtreleyin. Tamamlandıktan sonra, hareket eden hücreler ekranını şeffaf bir profile ayarlayarak sonraki adımlar için puncta'yı görselleştirin. Bireysel PSD95 noktalarını tespit etmek için, nesne araç çubuğundaki mavi yüzey simgesine tıklayın.

Sonra, zaman içinde takip noktalarını seçin, noktaları sınıflandırın, nesne-nesne istatistiklerini belirleyin ve oynat tuşuna basın. Sinaptik işaretleyici için kaynak kanalı seçin. Sadece PSD95'i görselleştirmek için dilimleyiciyi ve diğer kanalları kapatın.

Kontrol düğmesini ve işaretçi seçim aracını kullanarak noktanın XY çapını tahmin edin. Çerçeveler boyunca devam eden birkaç parlak nokta seçin ve arka plandan çıkarmayı kapatın. Sonra, spot kalitesine göre bir filtre ekleyin.

Histogramı, tüm zaman dilimlerinde doğru PSD95 noktasını dahil edecek şekilde ayarlayın. Yanlış pozitif noktaları düzenleme yoluyla kaldırın. Küp veya daire imleci arasında geçiş yaparak sadece bir veya iki kare süren noktaları silin.

Istenirse, izin verilen boşluk eşiği belirleyin ve sinaptik noktalar için takip algoritmasını seçin. Gerçek nokta izlerini filtreleyin; küçük nesne izlerini dışlamak için histogram eşiği kullanılır. Sınıflandırmaları en kısa yüzey mesafesi sınıflandırması kullanılarak tanımlayın.

Sıfır mikrometreden küçük herhangi bir puncta gibi kaplı, yüzeyden yaklaşık 0 ila 0,5 mikrometre arasında temas edilen, temassız ise 0,5 artı mikrometre olarak yerleştirilir. Yukarıdaki sınıflandırmaları kullanarak olaylara etiket atayın. Yüzeyler ve noktalar mikroglia ve noktaları uygun şekilde temsil ettiğinde, tüm istatistikleri istatistikler sekmesi altında dışa aktarın.

Lazerle indüklenen göz hipertansiyonundan sonra mikroglia, kontrol tansiyonuna kıyasla süreç yer değiştirme süresinin arttığını göstermiştir. Lazerle tedavi edilen gözlerde mikroglial hız kontrol gözlerine göre anlamlı derecede yüksekti. Mikroglia ile PSD95 puncta arasındaki temas olaylarının sayısı lazer tedavisinden sonra arttı.

Zaman geçişli kayıtlar, lazerle tedavi edilen retinaların kontrol retinalarına kıyasla daha fazla mikroglial hareketlilik ve PSD95 puncta ile etkileşimlerin arttığını gösterdi. Önemli bulgularımız, farelerde geçici göz içi basınç yükselmesinden sonra mikroglia sayısı, karmaşıklık ve hareketliliğin arttığını ve sinaptik kolokalizasyonun arttığını göstermiştir. Protokolümüz, katarakt ve kornea opaklığı sorunlarını önlemeye yardımcı olan ex vivo görüntüleme sunuyor; böylece daha hızlı deneyler ve genel olarak daha yüksek veri kapasitesi için daha kolay kurulum sağlanıyor.

Bulgularımız, mikroglia-nöron etkileşimlerinin, hücresel iletişimin ve dinamiklerin transjenik floresan çizgiler kullanılarak görselleştirilmesini ve yüksek çözünürlüklü zaman geçişli görüntülemeyi mümkün kılarak araştırmaları ilerletmektedir.