Fizyolojik Boyutta Bir Mikroakışkan Kültür Cihazında Epitel Hücre Tek Katmanlarının Hazırlanması ve Yapısal Değerlendirilmesi
July 1st, 2022
Sunulan protokol, mikroakışkan dinamik kültür kanallarında ve geleneksel sabit kuyu statik kültür odalarında yapışkan hücre tabakası yapısını görselleştirmek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile falloidin bazlı filamentöz-aktin boyama tekniğinin geliştirilmesini ve kullanımını açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre katmanı akıcılığını, tek katmanlı oluşumu ve katman kalınlığı homojenliğini değerlendirmeye yardımcı olur.
Bu protokol, hücre kültürü deneyleri için giriş engelini azaltmaya hizmet eder ve araştırmacıların dinamik mikroakışkan ortamlarda kültürlenen yapışkan hücre tek katmanlarını değerlendirmelerini ve karakterize etmelerini sağlar. Bu tekniğin birincil avantajı, hücre tek katmanlı özelliklerinin hem nitel hem de nicel olarak değerlendirilmesini, daha ileri tek katmanlı bağımlı deneyler için bir temel oluşturacak şekilde sağlamasıdır. Bu yöntem, bir alveoler epitelin in vitro olarak özetlenmesini sağlar ve akut solunum sıkıntısı sendromu, ARDS ve ventilatöre bağlı akciğer hasarı, VILI sırasında dinamik yanıtların araştırılmasına izin verir.
Başlamak için tek kanallı bir akış dizisi edinin. Kapak cam yüzeyini ultrasonik bir banyoda temizleyin. Kapak camını oda sıcaklığında beş dakika boyunca poli-d-lizine batırın.
Sonra 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede kurutun. Ardından, çift taraflı yapıştırıcıları Mylar ara parçalarına yapıştırın. Makalede açıklandığı gibi lazerle kapak camına kesim yapın ve kanal kesiklerinin tam olarak hizalandığından emin olun.
En alttaki yapışkan şeride dikdörtgen bir kapak camı yapıştırın. Soyulmuş yapışkan kağıtları, yapıştırıcının hala açıkta kalan kısımlarını örtmek için kullanın. Montaj tamamlandıktan sonra, konstrüksiyona sağlam ve eşit basınç uygulayın.
Deiyonize suyla dolu bir şırınga kullanarak kanalı durulayın. Kanal muhafazasını ultraviyole sterilizatörde 30 dakika sterilize edin. Steril bir teknik kullanarak, kanalı PBS'de hazırlanan insan fibronektin çözeltisi ile tedavi edin ve 37 santigrat derecede en az 30 dakika inkübe edin.
Steril laminer akış davlumbazında,% 10 FBS ile RPMI 1640 ortamını kullanarak NCI H441 hücre süspansiyonunu hazırlayın. Kanalı ve bağlantı noktalarının bir kısmını doldurmak için bu hücre süspansiyonunun 0,25 mililitresini kullanın. Parlak alan mikroskobu kullanarak, hücrelerin kanallar içinde eşit olarak dağıldığını doğrulayın.
Medya rezervuarını ve stopcock'u kanala ekleyin. Kanalı% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede kültürlemeye başlayın. Kanal girişine bağlı steril bir ortam haznesinden kullanılmış medyayı kanaldan ve taze medyayı kanaldan kanala çekmek için programlanabilir bir şırınga pompası kullanın.
Kimyasal bir duman davlumbazında,% 4'lük bir formaldehit çözeltisini,% 1'lik bir çözelti oluşturmak ve uygun şekilde etiketlenmiş bir tüpte saklamak için DPBS'ye seyreltin. % 2 formaldehit çözeltisini benzer şekilde hazırlayın. Formaldehit çözeltilerini uygun şekilde etiketlenmiş beş mililitrelik şırıngalara aktarın.
Yıkama adımları için kullanılacak ayrı bir 20 mililitre şırıngaya 20 mililitre DPBS hazırlayın. Daha sonra, mikroakışkan kanalı kültür aparatından çıkarın ve kimyasal duman davlumbazına sabitleyin. Sabitleme ve boyama aparatını monte etmek için, erkek Luer kilidi ile hortum dikeni adaptörüne üç yönlü bir stopcock'un yan portuna bir transfer borusu parçası takın.
Ardından stopcock'u akış dizisinin giriş portuna bağlayın. Aynı tip hortum dikeni adaptörünü kullanarak mevcut stopcock'un çıkış portuna başka bir transfer borusu segmenti takın. Son olarak, şimdi atık hatları olarak belirlenen her iki transfer borusunun serbest uçlarını kimyasal ve biyolojik tehlikeye uygun bir atık konteynerine sabitleyin.
Durdurma musluğunun akış dizisi giriş portunu engellediğinden emin olun ve atık hattını DPBS ile yıkayın. Ardından, atık hattını engellemek için stopcock'u çevirin ve hücreleri iki mililitre DPBS ile yavaşça yıkayın. Kanaldan iki mililitre% 1 fiksatif yavaşça itin.
Beş dakika bekletin ve% 2 fiksatif ile tekrarlayın. Ardından, hücreleri daha önce gösterildiği gibi taze DPBS ile üç kez yıkayın. Makalede açıklandığı gibi% 0.1 saponin çözeltisini hazırlayın.
Yıkama adımlarında kullanılmak üzere 20 mililitrelik bir şırıngaya ek DPBS çekin. Tüpü alüminyum folyo ile örtün. Filamentli aktin boyama faloidin reaktifini ve bir çekirdek boyama Hoechst reaktifini% 0.1 saponin çözeltisine ekleyin.
Daha sonra çözeltiyi folyo kaplı bir şırıngaya aktarın. Atık hattını az miktarda geçirgenleştirici ve lekeleme çözeltisi ile yıkayın. Daha sonra iki mililitre çözeltiyi mikroakışkan kanala verin.
Işığı engellemek için kanalı alüminyum folyo ile örtün. 30 dakika sonra, kanalı hafifçe kurutmadan önce geçirgenleştirici çözeltiyi her biri beş dakika boyunca iki mililitre DPBS ile yıkayın. Bir mikropipet kullanarak, mikroakışkan kanala minimum miktarda yumuşak ayarlı solmaya karşı anti-solmaya karşı montaj maddesi ekleyerek alt yüzeyin tamamen kaplanmasını sağlayın.
Ardından kanalın ucunu kapatın. Bir parlak alan mikroskobu kullanarak, kanalı ışıktan korumak için bir kapta saklamadan önce hücre katmanının bütünlüğünü hızlı bir şekilde doğrulayın. İstenilen görüntü parametreleri ve koşulları karşılanana kadar referans taramaları ve z yığınları alarak görüntüleme konumlarını test edin.
Akış dizisi taban plakasını referans olarak kullanarak, kanalın uzunluğu boyunca çeşitli konumlarda z-yığınları oluşturun. Son olarak, hücre katmanı özelliklerini değerlendirmek için kesitsel verileri, derinlik haritası verilerini ve diğer ilgili özellikleri analiz edin. Tekniğin başarılı kullanımı, mikroakışkan dinamik kültür ortamında, giriş ve çıkıştan en az bir santimetre uzakta görüntü elde edilerek gösterilmiştir.
Temsili bir kültür süresi deneyinde, hücreler 24 saat boyunca kültürlendiğinde başarılı tek katmanlı üretim gözlendi. Ancak 48 saat boyunca kültürlendiğinde istenmeyen çok katmanlı oluşum görüldü. Beş mikroakışkan kanal görüntüleme yerinin her birinden toplanan veriler, artan kültür süresi ile artan kesitsel alan arasındaki ilişkiyi de ortaya koyarak, düzensiz tabaka oluşumunun veya aşırı büyümenin kültürden sonraki 48 saat içinde gerçekleştiğini düşündürmektedir.
24 saat boyunca kültürlenen mikroakışkan kanal içindeki merkezi bir konumun derinlik haritası elde edilmiştir, bu da tabaka özelliklerinin nitel değerlendirmesi için yararlıdır. Bu protokolün en önemli üç yönü, uygun kanal yapımı, doğru kültür ve ortam akış koşulları ve sabitleme ve boyama aparatının dikkatli kullanımıdır. Bu prosedürü takiben, üretilen hücre monokatmanlarının deneysel uygulanabilirliğini doğrulamak için paralel olarak elektrik hücresi-substrat empedans algılaması, ECIS veya transepitelyal elektrik direnci, TEER gibi başka yöntemler de kullanılabilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu protokol, konfokal lazer taramalı mikroskopi (CLSM) kullanarak yapışkan hücre katmanlarını görselleştirmek için falloidin bazlı bir boyama tekniğini açıklamaktadır. Hem mikroakışkan hem de statik kültür ortamlarında hücre katmanı konfluensi ve tekdüzelik değerlendirmesini kolaylaştırır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Mikroakışkanlar
Arka Plan
- Hücre kültürü deneyleri çeşitli biyolojik çalışmalar için esastır.
- Dinamik mikroakışkan ortamları fizyolojik koşulları daha iyi taklit edebilir.
- Hücre monokatmanlarının değerlendirilmesi hücresel yanıtların anlaşılması için önemlidir.
- Bu yöntem ARDS ve VILI gibi koşulların incelenmesine yardımcı olur.
Çalışmanın Amacı
- Hücre kültürü deneylerinde araştırmacılar için engelleri azaltmak.
- Hücre monokatmanlarının nitel ve nicel değerlendirmesini sağlamak.
- Monokatmana bağlı deneylerin daha da kolaylaştırılması.
Kullanılan Yöntemler
- Filamentoz-aktin görselleştirimi için falloidin boyama.
- Görüntüleme için konfokal lazer taramalı mikroskopi (CLSM).
- Dinamik kültür için tek kanallı akış dizilerinin kullanımı.
- Hücre yapışması için poli-d-lizin ile kapak camının hazırlanması.
Ana Sonuçlar
- Farklı kültür koşullarında yapışkan hücre katmanlarının başarılı görselleştirilmesi.
- Hücre katmanı konfluensi ve kalınlık tekdüzelik değerlendirmesi.
- Akut solunum koşullarında hücresel yanıtlara ilişkin içgörüler.
- In vitro alveoler epiteli çalışmak için güvenilir bir yöntemin kurulması.
Sonuçlar
- Bu teknik hücre kültürü çalışmaları için sağlam bir çerçeve sağlar.
- Dinamik ortamlarda hücre davranışı anlayışını geliştirir.
- Yöntem çeşitli biyolojik araştırma alanlarında uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Establishing uniform epithelial cell monolayers in physiologically relevant microfluidic devices is critical for predictive modeling of lung barrier function and injury mechanisms. This protocol enables quantitative and qualitative assessment of monolayer integrity, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking in respiratory disease research. Reliable monolayer evaluation underpins translational continuity from discovery through preclinical model development for conditions such as ARDS and VILI.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rigorous assessment of epithelial barrier formation in microphysiological systems.
- Supports mechanistic de-risking by confirming monolayer uniformity prior to functional assays.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of lung injury pathways in vitro.
Screening & Assay Development
- Provides standardized imaging and quantification of cell layer confluency for assay readiness.
- Ensures reproducibility and comparability across microfluidic and static culture platforms.
- Delivers quantitative outputs for downstream compound screening or perturbation studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro barrier models with disease-relevant lung microenvironments.
- Enables continuity from cell-based discovery to preclinical validation of respiratory therapeutics.
- Supports risk-adjusted advancement by confirming model fidelity before functional testing.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the interface of early discovery and preclinical model qualification, providing a foundation for lead identification and mechanistic studies in respiratory research.
- Discovery Biology: Validates epithelial monolayer formation to support hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Confirms assay readiness through quantitative imaging and layer uniformity metrics.
- Analytics: Generates reproducible structural data for cross-condition comparison and statistical analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by ensuring physiological relevance of cell layers.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to diverse lung cell types and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in barrier function studies and target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization across microfluidic culture experiments.
- Strategic Value: Reduces late-stage biological risk by ensuring model fidelity before functional or screening assays.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of respiratory disease programs through robust model qualification.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidic device assembly and cell culture techniques.
- Needs access to confocal microscopy and quantitative image analysis tools.
- Demands cross-team standardization of channel construction and staining protocols.
- Adaptable to various epithelial cell types with protocol optimization.
- Dependent on precise control of culture duration and media flow to avoid multilayer formation.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:48
Microfluidic Channel Fabrication and Pre‐Treatment
1:49
Cell Culture in the Microfluidic Channel
2:35
Cell Fixation
4:11
Cell Staining and Mounting
5:25
Cell Imaging with Confocal Microscopy
5:55
Results: Culture Duration Effects on Monolayer Production
6:52
Conclusion
