Name: Formalin-Sabit, Parafin-Gömülü Hücre Pelet İmmünohistokimya Kontrolleri için Standartlaştırılmış İşleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Keşfedin, 293T hücre hattı kullanarak immünohistokimya için formalin-sabit, parafin-gömülü hücre pelet kontrolleri oluşturma yöntemini. Bu protokol, antikor bağlanma özgüllüğünü değerlendirmede güvenilir standartlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Genentech'in Araştırma organizasyonundaki meslektaşlarımızın ve özellikle de yıllar içinde bu yöntemlerin geliştirilmesine katkıda bulunan Patoloji çekirdek (P-core) laboratuvarlarının işbirliğine teşekkür ederiz.

1. Hücre pelet hazırlama
<ol><li>Dört ila sekiz adet 150mm2 veya sekiz x T175 şişede, hücre hattı için önerilen ortam ve koşullardaki hücreleri %80-%90 oranında birleştirin. Örneğin, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı'nda (DMEM)% 10 fetal sığır serumu ve 2 mM L-glutamin15 ile 293T hücreleri büyütün. NOT: Hücreler, ilgilenilen hücre hattı için gerekli koşullar ve ortam kullanılarak büyütülmelidir16. Bu koşullar hücre hattına bağlı olarak değişebilir, ancak aşağı akış peletleme yöntemleri, kültür koşullarından bağımsız olarak hücre hatları için uyarlanabilir olmalıdır.</li>
	<li>Hücreler birleşmeye yakın olduğunda (% 80 -% 90), büyüme ortamını bir vakum pipeti ile aspire edin ve hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) içinde durulayın.</li>
	<li>Her şişeye 5 mL 5-10 mM EDTA ekleyin ve şişeleri 5-10 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Hücreleri yerinden çıkarmak için şişenin yan tarafına hafifçe dokunun. NOT: Tripsin kullanmayın, çünkü bu, bazı antijenleri olumsuz yönde etkileyecek yüzey epitoplarını parçalayabilir.<ol><li>Hücreler yerinden çıktıktan sonra, her şişeye hücre hattı için kullanılan 5 mL büyüme ortamını (örneğin, 293T hücreleri için DMEM) ekleyin, ardından hücreleri 50 mL konik tüplere aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Konik tüpleri oda sıcaklığında 930 x g'da 5 dakika boyunca santrifüj yapın. Santrifüjlemeden sonra, ortamı ve EDTA'yı vakum pipet aspirasyonu ile çıkarın.</li>
	<li>Hücre peletlerini 10-20 mL 1x PBS içinde yıkayın ve birden fazla plaka veya şişe kullanılıyorsa, plakalardan veya şişelerden ( Şekil 1'de gösterilen deneyde yaklaşık altı T175 şişe) hücreleri tek bir 50 mL konik tüpte toplayın.</li>
	<li>Tüpü 5 dakika boyunca 930 x g'de santrifüj yapın. Vakum pipeti ile santrifüjlemeden sonra PBS'yi aspire edin.</li>
	<li>Hücre pelet tüpünü fiksasyona kadar ıslak buz üzerinde tutun. NOT: Degradatif enzim aktivitesini sınırlamak ve protein lokalizasyonundaki değişiklikler de dahil olmak üzere hücrelerin otolizini ve ilişkili protein değişikliklerini en aza indirmek için hücreler soğutulmuş halde tutulur.</li>
</ol>2. Hücre peletinin sabitlenmesi
<ol><li>10:1 (vol:vol) fiksatif hücre oranı oluşturmak için 3 mL hücre peletine 30 mL% 10 nötr tamponlu formalin ekleyerek fiksasyon gerçekleştirin.</li>
	<li>Sıkıca kapatılmış 50 mL tüpü, hücreler tamamen süspansiyona girene kadar tekrar tekrar ters çevirin. NOT: Tam fiksasyondan önce yoğunlaştırılmış bir hücre peletinin oluşumu, düzensiz fiksasyona neden olabilir, bu da daha sonraki boyama ve immünoetiketleme prosedürleri sırasında artefaktlara neden olabilir.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunun gece boyunca oda sıcaklığında yerleşmesine izin verin.</li>
	<li>Hücreleri yeniden askıya almak için ertesi gün tüpü tekrar ters çevirin, fiksasyonu iyileştirmek için yüzey-hacim oranını artırın. NOT: Hücre peletinin vorteklenmesi, hücre hasarına neden olabileceğinden gerekli değildir veya önerilmez.</li>
</ol>3. Hücre peletinin kesilmesi ve işlenmesi
<ol><li>24 saatlik fiksasyondan sonra, 50 mL konik tüpü 10-15 dakika boyunca 5 ° C'de 930 x g'de santrifüj edin. Tüplerin sıkıca kapatıldığından, eşit olarak dağıtıldığından ve santrifüjde dengelendiğinden emin olun. NOT: Fiksasyon süreleri, laboratuvar tarafından kullanılan doku fiksasyon sürelerini veya belirli deney koşullarının gerekliliklerini yansıtacak şekilde değiştirilebilir.</li>
	<li>Santrifüjlemeden sonra, hücrelerin görünür bir pelet oluşturduğundan emin olun. Fiksatif, steril transfer pipeti ile dekantasyon ve/veya dikkatlice aspire ederek çıkarın.</li>
	<li>Erimiş (40-60 °C) hidroksietil agaroz bazlı jeli (bakınız Malzeme Tablosu) hücre peletine 1:4 (vol:vol) jel-hücre pelet oranında ekleyin.</li>
	<li>Musluk suyuyla durulanmış bir göze sahip temiz bir 5 inç, 2 mm uçlu Sterling probu kullanarak, erimiş jeli sabit hücre peletine hafifçe karıştırın ve 50 mL konik tüpün dibinde erimiş jelde sabit hücrelerin eşit bir süspansiyonunu oluşturun (Şekil 1A).</li>
	<li>Kapaklı 50 mL konik tüpü, jelleşmiş hücre peletini katılaştırmak için ıslak buz üzerine 5-10 dakika boyunca sabit hücreli pelet ile karıştırılmış erimiş jel ile yerleştirin.</li>
	<li>Temiz bir mikro-spatula kullanarak, tüpün yan tarafına bir spatula yerleştirerek ve peleti delmeden hafifçe kaldırarak peleti konik tüpten dikkatlice çıkarın. Peleti biyopsi kağıdına yerleştirin.</li>
	<li>Temiz bir mikro-spatula kullanarak, hücre peletini 4-5 mm kalınlığında dilimler halinde kesin, böylece her dilim 26 mm x 26 mm x 5 mm doku kasetine sığabilir (Şekil 1B).</li>
	<li>Tek tek jel pelet dilimlerini bir parça biyopsi kağıdının ortasına yerleştirin. Biyopsi kağıdının iki karşıt ucunu pelet üzerine katlayın ve sarın. Sarılmış peleti 26 mm x 26 mm x 5 mm doku kasetine yerleştirin. Kapağı kapatın, biyopsi sargısının açılmış taraflarını doku kaseti kapağı ile sıkın (Şekil 1C).</li>
	<li>Kesilmiş hücre pelet kaseti,% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş doku işlemcisi imbiğine yerleştirin ve kısa bir işleme programında çalıştırın. NOT: Kısa işleme programı, her bir imbikte% 10 nötr tamponlu formalinden başlayan, giderek artan derecelendirilmiş alkollerden dehidre edilen, üç ksilen değişiminde temizlenen ve 60 ° C erimiş infiltrasyon / gömme parafin (56 ° C erime noktası) iki değişikliğinde parafin infiltrasyonu ile sona eren 30 dakikadan oluşur.</li>
</ol>4. Hücre peletinin gömülmesi
<ol><li>İşlenen kasetleri gömme merkezinin tutma alanına yerleştirin.</li>
	<li>Doku kaseti kapağını açın ve biyopsi kağıdını dikkatlice açın.</li>
	<li>Hücre peletini 15 mm x 15 mm boyutlarında, kesilmiş tarafı aşağı doğru küçük bir tek kullanımlık gömme kalıbına yerleştirin. NOT: Küçük bir gömme kalıbı, IHC testleri için lekesiz bir doku slaytına üç adede kadar hücre pelet bölümünün sığmasını sağlar.</li>
	<li>Hücre peletini forseps ile kalıbın dibinde nazikçe tutarken, hücre peletini kaplayan 62 °C doku infiltrasyonu / parafini kalıba gömün.</li>
	<li>Parafini katılaştırmaya başlamak için kalıbı soğuk bir bloğa taşıyın. Parafin katılaşırken hücre peletlerini, kalıbın dibinde uygun konumlarına sabitlemek için ayarlayın.</li>
	<li>Kapağı kasetten çıkarın. Kaseti alt tarafı aşağıya, gömme kalıbının üstüne yerleştirin ve kaseti örtmek için ilave erimiş parafin ekleyin.</li>
	<li>Parafin doku kaseti üzerine doldurulduğunda,17,18'i katılaştırmak için kalıbı soğuk bloğa geri koyun.</li>
</ol>5. Hücre peletinin bölümlenmesi
<ol><li>Parafin bloğunun tam yüzü ve hücre peleti parafin kesit şeridinde yakalanana kadar hücre pelet bloğunu kesmek için 20 μm'lik bir kesit kalınlığında bir döner mikrotom seti kullanın. Buna bloğa "bakmak" denir.</li>
	<li>Kesitlemeden önce bloğu soğutmak ve nemlendirmek için yüz pelet bloklarını bir buz banyosu tepsisinde 5-15 dakika soğutun ve ıslatın. NOT: Blok hidratlandığında, hücre peleti parafin şeridinde yarı saydam olacaktır. Opaksa, daha fazla ıslatma gerekir ve eserler mevcut olabilir.</li>
	<li>Hücre pelet bloğunun parafin şeridini 4 μm kalınlığında veya istenen diğer kalınlıkta döner bir mikrotom kullanarak sürekli kesme modunda kesitleyin.</li>
	<li>Parafin şeritleri 42 ° C'ye ayarlanmış bir su yüzdürme banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>Döner mikrotom kullanılarak hazırlanan parafin kesitlerini yüzdürme banyosundan pozitif yüklü slaytlara alın.<ol><li>İlk bölümü, kapağın kayması ve boyama sınırı içinde slaytın üst kısmına, ikincisini altına ve üçüncü hücre pelet bölümünü bunun altına yerleştirin (Şekil 1D).</li>
		<li>Kesitlemeden sonra, slaytları 24 saat boyunca oda sıcaklığında (yaklaşık 23 ° C), ardından 30 dakika boyunca 60 ° C'de kurutun. NOT: Slaytlar 60 °C'de pişirildikten sonra, hücre pelet bölümleri, ısıya bağlı ve enzim bazlı antijen alımları kullanan protokoller de dahil olmak üzere herhangi bir standart IHC protokolü ile kullanılabilir9.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Wennerberg, A. E., Nalesnik, M. A., Coleman, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+paraffin+1%3A+a+monoclonal+antibody+that+reacts+with+hepatocytes+and+can+be+used+for+differential+diagnosis+of+hepatic+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte paraffin 1: a monoclonal antibody that reacts with hepatocytes and can be used for differential diagnosis of hepatic tumors.</a> American Journal of Pathology. 143 (4), 1050-1054 (1993).</li>
<li>Chu, P. G., Ishizawa, S., Wu, E., Weiss, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocyte+antigen+as+a+marker+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Surgical+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hepatocyte antigen as a marker of hepatocellular carcinoma.</a> American Journal of Surgical Pathology. 26 (8), 978-988 (2002).</li>
<li>Cobleigh, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multinational+study+of+the+efficacy+and+safety+of+humanized+anti-HER2+monoclonal+antibody+in+women+who+have+HER2-overexpressing+metastatic+breast+cancer+that+has+progressed+after+chemotherapy+for+metastatic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Multinational study of the efficacy and safety of humanized anti-HER2 monoclonal antibody in women who have HER2-overexpressing metastatic breast cancer that has progressed after chemotherapy for metastatic disease.</a> Journal of Clinical Oncology. 17 (9), 2639-2648 (1999).</li>
<li>Vogel, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+and+safety+of+trastuzumab+as+a+single+agent+in+first-line+treatment+of+HER2-overexpressing+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Efficacy and safety of trastuzumab as a single agent in first-line treatment of HER2-overexpressing metastatic breast cancer.</a> Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 719-726 (2002).</li>
<li>Webster, J. D., Miller, M. A., DuSold, D., Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+formalin+fixation+on+the+immunohistochemical+detection+of+infectious+agents+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged formalin fixation on the immunohistochemical detection of infectious agents in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Veterinary Pathology. 47 (3), 529-535 (2010).</li>
<li>Havnar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+tumor-immune+microenvironment+by+high-throughput+image+analysis+of+CD8+immunohistochemistry+combined+with+modified+Masson%27s+trichrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of tumor-immune microenvironment by high-throughput image analysis of CD8 immunohistochemistry combined with modified Masson's trichrome.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 69 (9), 611-615 (2021).</li>
<li>Newton, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RIPK1+inhibits+ZPB1-driven+necroptosis+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RIPK1 inhibits ZPB1-driven necroptosis during development.</a> Nature. 540 (7631), 129-133 (2016).</li>
<li>Webster, J. D., Solon, M., Haller, S., Newton, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+necroptosis+by+phospho-RIPK3+immunohistochemical+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Detection of necroptosis by phospho-RIPK3 immunohistochemical labeling.</a> Methods in Molecular Biology. 1857, 153-160 (2018).</li>
<li>Ramos, J. A., Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+antibodies+and+antigens+get+along%3A+revisiting+the+technical+aspects+of+immunohistochemistry-the+red%2C+brown%2C+and+blue+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">When antibodies and antigens get along: revisiting the technical aspects of immunohistochemistry-the red, brown, and blue technique.</a> Veterinary Pathology. 51 (1), 42-87 (2014).</li>
<li>Webster, J. D., Solon, M., Gibson-Corley, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validating+immunohistochemistry+assay+specificity+in+investigative+studies%3A+consideration+for+a+weight+of+evidence+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Validating immunohistochemistry assay specificity in investigative studies: consideration for a weight of evidence approach.</a> Veterinary Pathology. 58 (5), 829-840 (2021).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((American+association+of+veterinary+laboratory+diagnosticians+subcommittee+on+standardization+of+immunohistochemistry+suggested+guidelines+for+immunohistochemical+techniques+in+veterinary+diagnostic+laboratories%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Veterinary+Diagnostic+Investigation%22%5BJournal%5D)">American association of veterinary laboratory diagnosticians subcommittee on standardization of immunohistochemistry suggested guidelines for immunohistochemical techniques in veterinary diagnostic laboratories.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 20 (4), 393-413 (2008).</li>
<li>Dominguez, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+inactivation+of+RIP1+kinase+does+not+ameliorate+disease+in+a+mouse+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Genetic inactivation of RIP1 kinase does not ameliorate disease in a mouse model of ALS.</a> Cell Death and Differentiation. 28 (3), 915-931 (2021).</li>
<li>Lean, F. Z. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+susceptibility+of+SARS-CoV-2+in+animals%3A+evidence+of+ACE2+host+receptor+distribution+in+companion+animals%2C+livestock+and+wildlife+by+immunohistochemical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Transboundary+and+Emerging+Disease%22%5BJournal%5D)">Differential susceptibility of SARS-CoV-2 in animals: evidence of ACE2 host receptor distribution in companion animals, livestock and wildlife by immunohistochemical characterization.</a> Transboundary and Emerging Disease. , 14232(2021).</li>
<li>Dunstan, R. W., Wharton, K. A., Quigley, C., Lowe, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+immunohistochemistry+for+biomarker+assessment-can+it+compete+with+other+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">The use of immunohistochemistry for biomarker assessment-can it compete with other technologies.</a> Toxicologic Pathology. 39 (6), 988-1002 (2011).</li>
<li>Atcc.org. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.atcc.org">http://www.atcc.org</a> (2022).</li>
<li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Cell+Culture+Basics+Handbook%22">Cell Culture Basics Handbook</a>. , Gibco. (2020).</li>
<li>Carson, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCarson%2C+F+%22Histotechnology%3A+A+Self-Instructional+Text%2C+2nd+Ed%22">Histotechnology: A Self-Instructional Text, 2nd Ed</a>. , ASCP Press. Chicago, IL. (1997).</li>
<li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Tissue Processing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSuvarna%2C+SK+%22Bancroft%27s+Theory+and+Practice+of+Histological+Techniques%2C+7th+Ed%22">Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques, 7th Ed</a>. Spencer, L. T., Bancroft, J. D. , Churchill Livingstone-Elsevier. China. (2013).</li>
<li>Dancau, A. M., Simon, R., Mirlacher, M., Sauter, G. Tissue Microarrays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDancau%2C+AM+%22Cancer+Gene+Profiling%22">Cancer Gene Profiling</a>. , Humana Press. New York. 53-65 (2016).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-programmed+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">RNA-programmed genome editing in human cells.</a> eLife. 2, 00471(2013).</li>
<li>Hewitt, S. M., Baskin, D. G., Frevert, C. W., Stahl, W. L., Rosa-Molinar, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+immunohistochemistry%3A+The+Histochemical+Society%27s+standards+of+practice+for+validation+of+immunohistochemical+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Controls for immunohistochemistry: The Histochemical Society's standards of practice for validation of immunohistochemical assays.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 62 (10), 693-697 (2014).</li>
<li>Ferrando, R., Newton, K., Chu, F., Webster, J., French, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+detection+of+FLAG-tagged+endogenous+proteins+in+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical detection of FLAG-tagged endogenous proteins in knock-in mice.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 63 (4), 244-255 (2015).</li>
<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nature Medicine. 4 (7), 844-847 (1998).</li>
<li>Moch, H., Kononen, J., Kallioniemi, O. P., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+microarrays%3A+what+will+they+bring+to+molecular+and+anatomic+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Anatomic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Tissue microarrays: what will they bring to molecular and anatomic pathology.</a> Advances in Anatomic Pathology. 8 (1), 14-20 (2001).</li>
</ol>

Tüm yazarlar Genentech/Roche çalışanıdır ve Roche'un hissedarlarıdır.

Bu protokol, aşağı akış immünohistokimyası ve in situ hibridizasyon çalışmaları için kontrol olarak kullanılabilecek formalin sabit, parafin gömülü hücre peletleri üretmek için bir metodolojiyi açıklamaktadır. Bu protokolde açıklanan histoloji metodolojileri, çeşitli kanser ve birincil hücre hatlarına uygulanabilir ve öncelikle bu peletleri üretmek için rutin histoloji tekniklerini uyarlar17,18. İşlendiğinde ve gömüldüğünde, peletler dokulara benzer şekilde kullanılabilir. Bu, immünohistokimya deneyleri için ısıya bağlı ve enzimatik antijen geri kazanım protokolleri ile birlikte kullanılmasını içerir. Bu protokolde kullanılan metodolojilerin bir amacı, süreç boyunca hücrelerin morfolojisini ve antijenitesini korumaktır. Bu nedenle, hem morfolojideki hem de antijenitedeki değişiklikler açısından nispeten yumuşak olan EDTA, hücrelerin ayrılması için kullanılır. Bu, fiziksel bozulma gibi diğer yaklaşımların uygulanabilir olmadığı anlamına gelmez; Bununla birlikte, hücreleri ayırmaya yönelik herhangi bir yaklaşım, hücrelerin süreçte zarar görmemesini sağlamalıdır. Bu protokolün ikinci amacı, hücreleri dokulara benzer bir şekilde, aynı fiksatif, fiksatif oranı, işleme programını (fiksasyon, dehidrasyon, temizleme ve parafin infiltrasyonu) ve gömme tekniklerini kullanarak sabitlemek ve işlemektir, böylece aşağı akış tahlilleri için karşılaştırılabilir kontroller olarak hizmet edebilirler. Bu nedenle, hücre peletleri üretmek için kullanılan fiksasyon ve işleme yaklaşımları, dokular için kullanılan yaklaşımları taklit etmelidir.
Bu raporda açıklanan protokol, patojenik bakteri veya virüslerle enfekte olmuş hücreler gibi bulaşıcı ajanlara sahip hücreleri işlemek için uyarlanmamıştır, çünkü hücreler fiksasyondan önce ayrılır, toplanır ve santrifüj edilir. Araştırmacılar, ayrılmadan önce hücreleri sabitlemek için protokolleri düşünebilirler, ancak bu, hücre morfolojisini bozmadan hücreleri toplamak için daha fazla optimizasyon gerektirecektir. Ayrıca, enfeksiyöz ajanlı hücreler için fiksasyon süreleri ve taşıma koşulları, enfeksiyöz ajana ve ilgili kurumsal biyogüvenlik protokollerine dayanan ek hususlar gerektirir.
Formalin-sabit, parafin-gömülü hücre peletleri, iyi tanımlanmış protein ekspresyon seviyelerine sahip olma konusunda benzersiz bir avantaja sahiptir10. Kanser ve endojen hücre hatları, farklı seviyelerde protein ekspresyonuna sahip hücrelerin bir seçimini sunarken, genetik mühendisliği teknolojileri, bilim adamlarının, ilgilenilen proteinleri aşırı ifade ederek ve ilgi çekici kodlama genlerini çıkarmak veya eklemek için CRISPR teknolojilerinin kullanılması yoluyla protein ekspresyonunu modellemelerini sağlar20,21 . Hücre hatlarında aşırı eksprese edilen proteinlerin dezavantajı, endojen protein seviyelerini temsil etmeyebilecekleri için bir tahlilin duyarlılığı için zayıf ölçümler olmalarıdır22. Buna karşılık, hem endojen hücre hatları hem de kanser hücre hatları endojen ekspresyon seviyelerini daha iyi temsil edebilir ve bir konyak hattındaki kodlama geninin CRISPR aracılı silinmesi, karşılık gelen bir negatif kontrol görevi görebilir. Ayrıca, endojen hücre hatları veya farklı seviyelerde protein ekspresyonuna sahip kanser hücre hatları, nihai antikor seyreltmelerini seçmek ve bir tahlilin duyarlılığını en iyi şekilde anlamak için titrasyon deneyleri için idealdir (Şekil 2). Hangi hücre hatlarının kullanılacağını çevreleyen karar, bireysel deneysel ihtiyaçlara dayanmalıdır ve genellikle yaklaşımların bir kombinasyonunu kullanacaktır.
Bir antikorun ilgilenilen proteini tespit edip edemeyeceğini değerlendirmenin yanı sıra, bir antikorun özgüllüğünü tanımlamak için bir hücre hatları paneli kullanılabilir. Örneğin, yakından ilişkili proteinlerden oluşan bir aileyi ayrı ayrı ifade eden bir hücre hatları paneli, bir antikorun bireysel bir protein için spesifik olup olmadığını veya yakından ilişkili diğer proteinleri de tespit edip etmediğini test etmek için kullanılabilir. Daha ayrıntılı kontroller, CRISPR knock-in veya aşırı ekspresyon yoluyla, tespit edilmekte olan spesifik sinyal olaylarına (örneğin, fosfo-spesifik bir antikoru değerlendirirken spesifik fosforilasyon bölgelerindeki mutasyon) maruz kalamayan nokta mutasyonlarına sahip proteinleri eksprese eden hücre hatlarının kullanılmasını içerebilir. Bunlar daha karmaşık yaklaşımlar olsa da, antikorun belirli koşullar altında sadece etiket kullandığını doğrulamak için gerekli olabilirler10.
Hücre hatlarının genetik manipülasyonlarının homojen bir hücre popülasyonu oluşturmayabileceğine dikkat etmek önemlidir. Örneğin, hücre çizgilerini aşırı eksprese etmede transfeksiyon etkinliği tipik olarak% 100 değildir ve bazı hücreler ilgilenilen proteini aşırı eksprese etmeyebilir. Transfeksiyona standart yöntemlerle tespit edilebilen FLAG veya ilgili bir etiketin dahil edilmesi, hücre satırı23'ün transfeksiyon verimliliğini değerlendirmek için yararlı olabilir. Bu, hem transfeksiyonun başarılı olup olmadığını belirlemek hem de protein ekspresyonu nedeniyle tespit eksikliğini dışlamak ve ilgilenilen proteini ifade etmesi gereken hücrelerin beklenen oranı için bir referans görevi görmek için yararlı olabilir.
In situ hibridizasyon (ISH), hücre peletlerindeki hedef gen ekspresyonunu karakterize etmek ve IHC yöntem gelişimini bilgilendirmek için yararlı bir araç olabilir10. Antikorları tararken, transkriptin ve dolayısıyla potansiyel proteinin ne zaman tespit edilebileceğini bilmek bilgilendirici olabilir. Ek olarak, hücre peleti ISH taraması ISH yönteminin geliştirilmesi için faydalı olabilir. Özgüllük, ISH tahlilleri için daha az sıklıkla bir sorun olsa da, ISH çalışmalarına uygulanabilecek kontrollerin geliştirilmesi ve kullanılması için uygun kontrollere ve benzer hususlara sahip olmak hala önemlidir.
Doku mikrodizileri, çekirdeklerin donör bloklardan çıkarılması ve bu çekirdeklerin, genellikle ızgara düzeninde, bir alıcı parafin bloğuna aktarılmasıyla oluşturulur. Sonunda, alıcı blok tek bir blokta bir numune spektrumu içerir, bu da bloktaki tüm numunelerin aynı IHC prosedürlerinden geçmesine izin verir ve aynı slayt24,25'teki birden fazla numunenin doğrudan karşılaştırılmasına izin verir. Hücre peletleri nispeten homojen popülasyonlar olduğundan, 1 mm çekirdeklerle doğru bir şekilde temsil edilebilirler, bu da onları benzer dizilere dahil etmek için ideal adaylar haline getirir. Bir hücre pelet dizisi kullanarak, farklı ekspresyon seviyelerine sahip hücre peletlerini, ilgili proteinleri benzersiz bir şekilde ifade eden hücre peletlerini ve farklı türlerden ilgilenilen proteinin ortologlarını eksprese eden hücre peletlerini tek bir slaytta dahil etmek mümkündür (Şekil 3). Bu, tüm hücre peletlerinin aynı anda tek tip koşullar altında hızlı bir şekilde değerlendirilmesini sağlarken, reaktiflerin kullanımını en aza indirir25.
Bu protokol için sekiz T175 şişesinden toplanan minimum 2 mL'lik bir başlangıç hücresi pelet hacmi önerilir. Bu hacim, çoklu hücre pelet bloklarının üretilmesine ve arşivlenmesine izin verir, böylece hücre pelet kontrolleri daha uzun süreler boyunca standartlaştırılabilir ve belirli bir peletten çoklu hücre pelet dizileri oluşturulabilir. Alt hücre pelet hacimleri, birincil hasta kaynaklı hücre hatları, yavaş büyüyen hücre hatları ile uğraşırken veya koşullar numunenin hacmini sınırladığında kullanılabilir. Tabii ki, daha düşük başlangıç hacimleri, peletin sabitlenmesi ve hazırlanması sırasında herhangi bir hücre kaybından kaynaklanan olumsuz etkiyi güçlendirecek ve aşağı akış prosesleri için mevcut malzemeyi sınırlayacaktır. Santrifüjlemeden sonra fiksatif çıkarılırken, ilişkili kayıpları en aza indirmek için özellikle dikkat etmek önemlidir. Daha düşük numune hacimleri için, hücreleri peletlemek için 1,5 mL, kapaklı bir santrifüj tüpü kullanılabilir. Bu tüpler, işleme için bir bıçakla uzunlamasına ikiye bölünebilir.
Doku fiksasyonuna benzer şekilde, bu pelet içindeki hücre fiksasyonu, aşağı akış IHC değerlendirmeleri için kritik öneme sahiptir. Tam fiksasyon elde etmek için, en az 10: 1 formalin - hücre pelet oranı kullanıyoruz ve hücreleri süspansiyonda tutmak için konik tüpü tersine çeviriyoruz. Fiksasyon sırasında hücreler süspansiyonda değilse, aşağı akış immünoetiketlemesini etkileyecek eksik veya yetersiz fiksasyon riski vardır. Genellikle bu, çevrede güçlü etiketleme ve pelet merkezinde etiketleme kaybı veya pelet boyunca değişken yoğunlukta etiketleme olarak kendini gösterir.
Bu protokol, hem hücre peletini bağlamak hem de hücrelerin hücre peleti boyunca eşit olarak dağılmasını sağlamak için öncelikle hidroksietil agarozdan oluşan Histogel'i kullanır. Onsuz, hücreler sıkışır ve sitomorfolojik ayrıntılarını kaybeder. Bu sitomorfolojik detaylar genellikle antikor taraması sırasında önemlidir, çünkü antikorun uygun hücre altı bölmede (örneğin, çekirdek, sitoplazma veya plazma zarı) etiketlenip etiketlenmediğine dair ek bilgi sağlarlar. Buna karşılık, çok fazla jel, pelet içinde daha düşük hücre yoğunluklarına neden olabilir, bu da hücrelerin yaygın olarak dağılmasına ve bölüm başına hücre sayısının azalmasına neden olabilir.
Bu protokol, IHC kontrollerini geliştirmek için rutin olarak kullanılabilir. Bu peletleri oluşturmak için gereken malzemeler araştırmacı biyoloji ve histoloji laboratuvarlarında yaygındır ve yöntemler basit ve uyarlanması kolaydır. Hücre peletleri IHC kontrolleri olarak sınırlamalara sahip olsa da, ilk antikor taraması için harika araçlar olarak hizmet ederler ve diğer doku kontrollerini tamamlarlar.

İmmünohistokimya (IHC), araştırmacı ve tanısal patolojide en sık kullanılan testlerden biridir. Bağlama ve tahlil bağlı olarak, IHC kanser tanısında yardımcı olmakiçin kullanılır 1,2, tedavi yanıtı 3,4'ü tahmin etmek, patojenleri tanımlamak5, hastalıklı dokulardaki hücre tiplerini karakterize etmek6 ve biyolojik yolları ve doku yanıtlarını incelemek 7,8. Her durumda, bir IHC testinin temel prensibi, bir antikorun özellikle ilgilenilen bir hedefe, en yaygın olarak bir proteine bağlanmasıdır ve bu bağlanma olayı daha sonra bir doku bölüm9'da görselleştirilir. Bununla birlikte, herhangi bir IHC testinin en büyük zorluklarından biri, antikorların özellikle ilgilenilen hedefi tespit etmesinisağlamaktır 10. Antikor özgüllüğü çoğu immünotahlilde bir zorluktur, ancak immünohistokimya, spesifik ve spesifik olmayan etiketlemeyi ayırt etmek için moleküler ağırlık gibi ikincil önlemlerin bulunmaması nedeniyle benzersiz zorluklar sunar. Bu, iyi tanımlanmış hücresel lokalizasyon paternlerinden yoksun, kötü karakterize edilmiş veya her yerde ifade edilen hedefleri değerlendirirken özellikle zahmetlidir. Bu nedenle, yeni bir IHC testi 10 geliştirilirken bağlayıcı özgüllüğün karakterize edilmesine yardımcı olabilecek sağlam kontroller kritiköneme sahiptir.
Karakteristik hücresel ekspresyon paternleri ile iyi tanımlanmış hedefler için, doku kontrolleri IHC yöntemi geliştirmelerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Önceki verilerin zenginliğine dayanarak, antikorun eksprese edildiği bilinen dokuyu, hücreyi ve hücre altı bölmeyi etiketleyip etiketlemediği ve bulunmaması gereken doku bileşenlerini etiketlemediği belirlenebilir11. Bununla birlikte, doku kontrolleri, bilinen ekspresyon kalıpları olmayan kötü karakterize edilmiş, yeni hedefler veya yaygın olarak eksprese edilen ve farklı ekspresyon kalıplarından yoksun proteinler için sınırlı bir kullanıma sahiptir. Bu senaryoların her ikisinde de, iyi tanımlanmış bir ifade kalıbının olmaması, dokulardaki spesifik olmayan etiketlemeden spesifik olanı ayırt etmeyi imkansız kılar. Bu durumlarda, hücre peletleri değerli bir alternatif IHC kontrolü sunar. Hücre pelet kontrolleri şunları içerebilir: ilgilenilen proteinin endojen veya intrinsik / indüklenmemiş ekspresyon seviyelerine sahip olan ve protein ekspresyonu batı lekelenmesi, akış sitometrik analizleri ile karakterize edilebilen veya transkripsiyonel profillemeden ekstrapolasyon yapılabilen kanser veya diğer hücre hatları; ilgilenilen proteini aşırı eksprese eden veya ilgilenilen kodlama genini sildiren tasarlanmış hücre hatları; veya protein ekspresyonunu veya ilgili sinyal olaylarını (örneğin, fosforilasyon) indüklemek için belirli koşullar altında tedavi edilmiş hücreler 10,12. Hücre hatlarındaki iyi karakterize edilmiş protein ekspresyon seviyeleri, yüksek, orta, düşük ve eksik protein ekspresyonuna sahip bir hücre hatları paneli kullanarak bir tahlilin duyarlılığının değerlendirilmesine de izin verir. Ek olarak, mühendislik hücre peletleri, sınırlı karakterizasyonun veya mevcut doku kontrollerinin olabileceği veteriner türleri için değerli türlere özgü kontroller olabilir13. Hücre peletlerinin, dokulardaki çeşitli proteomları yansıtmayacak hücre hatlarında bulunan sınırlı proteom gibi sınırlamaları olsa da, antikorun ilgilenilen hedefi tespit edebileceğini doğrulamak ve birincil antikor, ikincil antikor veya tahlil10'daki diğer regentler tarafından ayrım gözetmeksizin bağlanmayı dışlamak için uygun kontroller olarak hizmet ederler.
Tanısal ve araştırmacı patolojideki dokuların çoğu, nötr tamponlu formalinde sabitlenir, bir dizi alkolde dehidre edilir, ksilen içinde temizlenir ve parafin mumunda işlenir ve gömülür. Formalin fiksasyonu proteinleri çapraz bağlar ve fiksasyon ve doku işlemedeki her ek adım, proteinleri ve antikorların bunları tespit etme yeteneğini doğrudan etkileyebilir 9,14. Bu nedenle, bir IHC testinde kullanılan herhangi bir kontrolün aynı fiksasyon, doku işleme ve gömme prosedürlerinden geçmesi önemlidir. Bu makalede, formalin sabit parafin gömülü dokularda IHC tahlillerinin geliştirilmesi için kontrol görevi görecek şekilde kültürlenmiş hücrelerin işlenmesi ve gömülmesi için benzersiz hususlar anlatılmaktadır ve metodoloji öncelikle bir histoloji laboratuvarında hücre peletinin işlenmesi ve işlenmesine odaklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>% 10 Nötr Tamponlu Formalin</td><td>VWR</td><td>16004-128</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik Tüp</td><td>Becton Dickinson Labware</td> <td># 0747-1886</td><td></td></tr>% <tr><td>70 Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>% 95 Etanol</td><td>Koptec</td><td>V1101</td><td></td></tr><tr><td>Biyopsi Sarar</td><td>Surgipath Medical Industries, Inc</td> <td># 01090</td><td></td></tr><tr><td>Costar Stripette serolojik pipet 10 mL</td><td>Corning</td><td>CLS4101</td><td></td></tr><tr><td>Flex 100</td><td>Epredia</td><td>8101</td><td></td></tr><tr><td>Flex 95</td><td>Epredia</td><td>8201</td><td></td></tr><tr><td>Histogel</td><td>Thermo Scientific</td><td>#R904012</td><td></td></tr><tr><td>Leica Otomatik Döner Mikrotom</td><td>Leica</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Spatula, yuvarlak ve konik uçlar</td><td>Tedd Pella</td><td>#13510</td><td></td></tr><tr><td>NanoZoomer 2.0 HT tam slayt görüntüleyici</td><td>Hamamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraplast Doku Sızması/Gömme Parafin</td><td>Surgipath</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Kontrol Cihazı</td><td>CAPP</td><td>PA-100</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif Alkol</td><td>Epredia</td><td>9111</td><td></td></tr><tr><td>Sterling Probu 5 "Gözlü 2mm Uç</td><td>Roboz Surgical Instrument Co., Inc</td><td>#RS-9522</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus pozitif yüklü mikroskop slaytları</td><td>Thermo Scientific</td><td>6776214</td><td></td></tr><tr><td>Doku kasetleri; PrintMate Oluklu Kaset</td><td>Epredia</td><td>B851120WH</td><td></td></tr><tr><td>TMA Doku Grand Master</td><td>3DHistech Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ksilenler</td><td>VWR</td><td>89370-088</td><td></td></tr></tbody></table>

formalin-sabit, parafin-gömülü hücre pelet İmmünohistokimya kontrolleri için standartlaştırılmış İşleme

Standardized Processing for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Cell Pellet Immunohistochemistry Controls

Hedef proteinlerin bilinen ekspresyonuna sahip pozitif ve negatif kontroller, immünohistokimya (IHC) tahlillerinin geliştirilmesi için gereklidir. Doku kontrolleri, tanımlanmış doku ve hücresel ekspresyon paternlerine sahip iyi karakterize edilmiş proteinler için faydalı olsa da, yeni, kötü karakterize edilmiş veya her yerde eksprese edilen proteinler için IHC tahlillerinin ilk gelişimi için daha az uygundur. Alternatif olarak, standartlaştırılmış doğaları nedeniyle, tanımlanmış protein veya transkript ekspresyon seviyelerine sahip kanser hücresi hatları (örneğin, yüksek, orta ve düşük ekspresyon), transfekte edilmiş aşırı eksprese edici hücre hatları veya CRISPR gibi hücre mühendisliği teknolojileri aracılığıyla silinen genlere sahip hücre hatları dahil olmak üzere hücre peletleri, özellikle ilk antikor karakterizasyonu ve seçimi için değerli kontroller olarak hizmet edebilir. Bu hücre peletlerinin formalin sabit, parafin gömülü dokular için IHC tahlillerinin geliştirilmesinde kullanılabilmesi için, doku işleme için kullanılan prosedürleri özetleyecek şekilde işlenmesi ve gömülmesi gerekir. Bu protokol, IHC yöntemi geliştirmeleri için kullanılabilecek formalin sabit, parafin gömülü hücre pelet kontrollerinin oluşturulması ve işlenmesi için bir süreci açıklar.

Agaroz bazlı jelin eklenmesini takiben, hücre peleti işlemeye uygun katı jelatinimsi bir kütle oluşturmalıdır (Şekil 1B). Gömüldükten sonra, pelet katı bir dokuya benzer bir kıvama sahip olacak ve bir mikrotom üzerinde rutin olarak kesilmesi nispeten kolay olmalıdır. Hücre peletleri gömüldükten sonra, histoloji ve IHC deneylerinde formalin sabit, parafin gömülü dokularla aynı şekilde kullanılabilirler. Bu, dolaylı kromojenik tespit yöntemleriyle (örneğin, yaban turpu peroksidaz ve Şekil 3'te gösterildiği gibi diaminobenzidin tespiti ile ikincil bir antikor kullanarak) ticari IHC platformları9 kullanılarak ısıya bağlı epitop veya enzimatik antijen alımının kullanımını içerir. Histolojik olarak, hücreler minimal hücre kümelenmesi ile bölüm boyunca eşit olarak dağılmalıdır, ancak yapışkan hücreler peletteki hücre-hücre etkileşimlerini koruyabilir. Bu dağılım, bireysel hücreler arasında ayrım yapılmasına izin verir, ancak bu ayrım, jel pelet içindeki hücre boyutu ve bağıl yoğunluktan önemli ölçüde etkilenecektir. Çekirdek, sitoplazma ve hücre zarı daha belirgindir ve dispersiyon üzerine görselleştirilmesi daha kolaydır (Şekil 2). Şekil 2'de, üç hücre hattı TEAD transkripsiyon faktörü için immüno-etiketlenmiştir. İmmünoetiketleme kahverengi diaminobenzidin (DAB) kromojen ile görselleştirilir. Hücre çizgileri, TEAD transkripsiyon faktörünün, ifade olmamasından (Şekil 2A) zayıf ifadeye (Şekil 2B), güçlü ifadeye (Şekil 2C) kadar değişen ifade seviyelerine sahiptir. Bu örnekte, bir transkripsiyon faktöründen beklendiği gibi çekirdekte etiketleme gözlenir ve görünür olan ancak etiketlemeden yoksun olan sitoplazma ve hücre zarında yoktur (Şekil 2). Hücre peletleri, standart 23 mm x 75 mm x 1 mm slaytlarda hücre pelet mikrodizilerine (Şekil 3) dahil edilebilir. Hücre peletlerinin bir mikrodiziye dahil edilmesi, aynı slaytta değişen ekspresyon seviyelerine sahip kontrollerin değerlendirilmesine olanak tanır. Bu örnekte, PEG10 eksikliği olan fare embriyonik kök hücreleri (solda) negatif kontrol görevi görür ve PEG10'u aşırı eksprese eden 293T hücreleri (sağda, kahverengi immünoetiketleme) mikrodizide pozitif bir kontrol görevi görür (Şekil 3). Mikrodizilere dahil edilecek hücre peletleri için doku ve gömme prosedürlerinde herhangi bir değişiklik yoktur ve dokular için kullanılanlara benzer yöntemler kullanılarak mikrodiziler üretilebilir19.
<img alt="Hücre işleme ve gömme iş akışı, numune hazırlamadan kesit almaya kadar adımları gösteren diyagram." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Şekil 1: Hücre pelet işleme . (A) Hücreler 50 mL konik tüplerde peletlenir ve jel ile karıştırılır. (B) Katılaştıktan sonra, peletler 26 mm x 26 mm x 5 mm doku kasetine sığacak şekilde seri olarak dilimlenir. (C) Hücre peletleri, doku işlemcisine yerleştirilmeden önce biyopsi kağıdına sarılır. (D) Tek bir 25 mm x 75 mm cam histoloji slaytında seri olarak üç hücreli peletler toplanabilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="İmmünohistokimya sonuçları; doku örneklerinde antikor boyama; A, B, C etiketli hücre işaretçileri." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Şekil 2: Tahlilin dinamik aralığını değerlendirmek için farklı seviyelerde protein veya transkript ekspresyonuna sahip hücre peletleri kullanılabilir. Hücre peletleri TEAD transkripsiyon faktörü için immüno-etiketlenmiştir ve farklı seviyelerde TEAD ekspresyonu göstermektedir. (A) DAUDI hücreleri TEAD ekspresyonundan yoksundur ve sitoplazmada veya çekirdekte immünoetiketlemeye sahip değildir. Mavi boya, çekirdeğin hematoksilin karşı boyasıdır. (B) 293T hücreleri, TEAD transkripsiyon faktörünün zayıf nükleer etiketlemesini (kahverengi diaminobenzidin (DAB) kromojeni) gösterir. (C) Detroit 562 hücreleri, çekirdekteki yoğun kahverengi etiketlemenin gösterdiği gibi TEAD'yi güçlü bir şekilde eksprese eder. Çekirdek içinde etiketleme, ancak sitoplazma (kahverengi çekirdeğin etrafındaki kirli beyazdan griye bölge) değil, immünohistokimya testinin uygun şekilde etiketlendiğini gösterir. Her üç hücre hattında, hücrelerin dağıldığını ve nükleer ve sitoplazmik morfolojileri de dahil olmak üzere tek tek hücrelerin görselleştirilmesine izin verdiğini unutmayın. Ölçek çubuğu = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Hücre boyama işlemi; doku örneklerini karşılaştıran mikroskop görüntüsü; Hücre yoğunluğundaki farklılıkları vurgular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64276/64276fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Şekil 3: Farklı protein ekspresyon seviyelerine sahip çoklu hücre peletleri kullanılarak oluşturulan hücre pelet mikrodizisi, kontrollerin tek bir slaytta eşzamanlı olarak değerlendirilmesine olanak sağlar. PEG10 eksikliği olan fare embriyonik kök hücreleri (solda) ve PEG10'u aşırı eksprese eden 293T hücreleri (sağda) PEG10 için immüno-etiketlenmiştir. PEG10'u aşırı eksprese eden 293T hücrelerinde güçlü etiketleme (kahverengi DAB kromojeni) gözlenirken, PEG10 eksik hücrelerinde hiçbir etiketleme belirgin değildir. Mavi hematoksilin karşı stainini temsil eder. Ölçek çubuğu = 200 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64276/64276fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada immünohistokimya için formalin-sabit, parafin-gömülü hücre pelet kontrolleri oluşturmak için bir protokol sunulmaktadır.

Formalin-Sabit, Parafin-Gömülü Hücre Pelet İmmünohistokimya Kontrolleri için Standartlaştırılmış İşleme

Positive and negative controls with known expression of target proteins are essential for the development of immunohistochemistry (IHC) assays. While ...

Tanımlanmış protein veya transkript ekspresyon düzeylerine sahip iyi karakterize pozitif ve negatif hücre pelet kontrolleri, immünohistokimya tahlillerinin geliştirilmesi için gereklidir. Bu protokol, formül sabit, parafin gömülü hücre pelet kontrollerinin oluşturulması ve işlenmesi için bir süreci açıklar. Bu kontroller, yeni bir immünohistokimya testi geliştirirken bağlanma özgüllüğünü karakterize etmek için kullanılabilir.IHC testleri, terapötik alanlardaki keşif ve biyobelirteç geliştirme çabalarımız için kritik öneme sahiptir ve doğrulanmış kontrollerin geliştirilmesi, bu tahlillerin geliştirilmesi için gereklidir. Hidroksietil agaroz bazlı jeli, hücre peletine eklemeden önce en az 40 santigrat dereceye ısıtmak önemlidir. Jel, katılaşmadan önce hücrelerle iyice karıştırılmalıdır.293T hücreli peletin fiksasyonuna, 10'a bir fiksatif hücre oranı oluşturmak için üç mililitrelik bir hücre peletine 30 mililitre% 10 nötr tamponlu formalin ekleyerek başlayın. Sıkıca kapatılmış 50 mililitrelik tüpü tekrar tekrar ters çevirerek hücreleri yeniden askıya alın ve gece boyunca oda sıcaklığında yerleşmelerine izin verin. Fiksasyonu iyileştirmek için, ertesi gün tüpü ters çevirerek ve hücreleri yeniden askıya alarak yüzey-hacim oranını artırın.24 saatlik fiksasyondan sonra, tüpü 10 ila 15 dakika boyunca beş santigrat derecede 930 kez G'de santrifüj edin. Hücre peletinin görünür olduğundan emin olun ve steril bir transfer pipeti kullanarak dekantasyonu yaparak veya dikkatlice aspire ederek fiksatifi çıkarın. Erimiş hidroksietil agaroz bazlı jeli 40 ila 60 santigrat derecede pelete bir ila dört jel hücre pelet oranında ekleyin.50 mililitrelik konik tüpün içeriğini nazikçe karıştırmak için musluk suyuyla durulanmış bir gözle temiz bir beş inç ve iki milimetre uçlu sterling probu kullanın ve alttaki erimiş jelde sabit hücrelerin eşit bir süspansiyonunu oluşturun. Erimiş jeldeki sabit hücreleri eşit şekilde askıya aldıktan sonra, kroniksel tüpü kapatın ve beş ila 10 dakika boyunca ıslak buzun üzerine yerleştirin. Jel pelet katılaştıktan sonra, tüpün yan tarafına dikkatlice temiz bir mikrospatula yerleştirin ve peleti delmeden yavaşça kullanın.Katılaşmış peleti biyopsi kağıdına yerleştirin. Temiz bir mikrospatula kullanarak, hücre peletini 26 milimetre x 26 milimetre x beş milimetre doku kasetine sığacak şekilde dört ila beş milimetre kalınlığında dilimler halinde kesin. Tek tek jel pelet dilimlerini bir parça biyopsi kağıdının ortasına yerleştirin.İki zıt tarafı katlayın ve dilimi 26 x 26 x beş milimetrelik bir doku kasetine yerleştirmeden önce kağıda sarın. Kapağı kapatın. Kesilmiş hücre pelet kasetini% 10 nötr tamponlu formalin ile doldurulmuş doku işlemcisi imbiğine yerleştirin ve kısa bir işleme programına göre çalıştırın.Hücre peletini gömmek için, işlenmiş kasetleri gömme merkezinin tutma alanına yerleştirin. Doku kaseti kapağını açın ve biyopsi kağıdını dikkatlice açın. Hücre peletini 15 x 15 milimetrelik tek kullanımlık küçük bir gömme kalıbına kesilmiş tarafa yerleştirin.Hücre peletini forseps ile kalıbın dibinde nazikçe tutarken, 62 santigrat derece doku infiltrasyonu ekleyin veya hücre peletini kaplayan kalıba parafin yerleştirin. Parafini katılaştırmak için kalıbı soğuk bir bloğa taşıyın. Parafin katılaşırken hücre peletini ayarlayın ve kalıbın dibinde uygun konuma sabitleyin.Kapağı kasetten çıkarın. Kaseti alt tarafını gömme kalıbının üstüne yerleştirin ve kaseti örtmek için ekstra erimiş parafin ekleyin. Parafin doku kaseti üzerine doldurulduğunda, katılaşma için kalıbı soğuk bloğa geri koyun.Döner mikrotom kullanılarak hazırlanan parafin kesitlerini yüzdürme banyosundan pozitif yüklü slaytlara alın. İlk bölümü slaytın üst kısmına, kapak kayması ve boyama sınırı içine yerleştirin, ardından sonraki bölümleri seri olarak birbirinin altına yerleştirin. Tamamlandığında, slaytları başlangıçta 24 saat boyunca 23 santigrat derecede, daha sonra 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede kurutun.Bu yöntem kullanılarak hazırlanan gömülü hücre peleti, kesit boyunca eşit bir hücre dağılımı gösterdi, minimum hücre kümelenmesi ve peletteki etkileşimler vardı. İmmünoetiketleme kahverengi diaminobenzen ile görselleştirildiğinde, kromozom ve üç hücre çizgisi, çekirdekte TEAD transkripsiyon faktörü ekspresyonunun farklı seviyelerinde, hayır'dan zayıfa, güçlü ekspresyona kadar değişen seviyelerde gözlendi. Hücre peletlerinin bir mikrodiziye dahil edilmesi, prosedürlerde değişiklik olmaksızın aynı slaytta değişen ekspresyon seviyelerine sahip kontrollerin değerlendirilmesine izin verdi.Bu örnekte gösterildiği gibi, PEG 10 eksik fare embriyonik kök hücrelerinin negatif kontrolü ve PEG 10'u aşırı eksprese eden 293T hücrelerinin pozitif kontrolü görülebilir. Hücrelerin yeterince sabitlenmesini ve jel pelet boyunca homojen bir şekilde dağıtılmasını sağlamak, tek tip standartlaştırılmış bir tahlil kontrolü oluşturur. Hücre peletleri, standart antijen geri kazanımı ve etiketleme yöntemleri ile aşağı akış immünohistokimya ve NC2 hibridizasyon testlerinde kontrol olarak kullanılabilir.Hücre pelet kontrolleri, özellikle yeni veya minimal olarak karakterize edilen proteinler için birçok immünohistokimya testinin geliştirilmesini sağlamıştır. Antikor özgüllüğünü karakterize etmeye yardımcı olabilecek iyi tanımlanmış kontroller olarak hizmet ederler.

standardized-processing-for-formalin-fixed-paraffin-embedded-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Aşağıdaki videoda, formalin fiksasyonu ve parafin gömme ile bir dokunun morfolojisinin nasıl korunacağı açıklanmaktadır.

Formalinle Sabit Parafin Gömülü (FFPE) Doku Koruma: Doku Morfolojisini İncelemek İçin Bir Yöntem

Biz burada, formalinle fiksasyonlu, parafine gömülü sıçan merkezi sinir sistemi (CNS) ve periferik lenf nodu (LN) doku kesitlerinde çift immün boyama için optimize edilmiş, ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Floresans in-situ hibridizasyon (balık), histopatoloji ve moleküler teşhis tedavi kişiselleştirilmiş tıp yelpazesi için birlikte genellikle gereklidir. Balık görüntülenmeden önce izin veren yüksek kaliteli morfolojik, moleküler ve balık analizleri aynı örnek buna ek olarak bir sonrası fiksasyon adım tarafından bir roman çapraz bağlama, formalin ücretsiz doku sabitleştirici.

HER2 için iletişim kuralı balık bir çapraz bağlama, Formalin ücretsiz doku sabitleştirici Cryo-koruma ve Formalin fiksasyon avantajları birleştirmek için kullanma

Morfolojik bilgi aynı zamanda gerekli olduğunda şu anda, immünfloresan sabit hücreleri üzerinde boyama seçim protein ifade düzeyleri tespiti için yöntemidir. Burada sunulan bu protokolü parafin gömülü hücre bloklar immunocytochemistry alternatif bir yöntem sağlar.

Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Nicel immunoblotting ayirt Histoloji formalin sabit, parafin gömülü (FFPE) doku örnekleri ilgi bir protein miktarının aracı olarak görüntü analizi ile birleştiğinde doğrulamak için nasıl kullanılacağını açıklar. Bizim sonuçlar biyomarker proteinler rutin biyopsi örneklerinde göreli miktarı ascertaining için ayirt Histoloji yarar gösterilmektedir.

Hücre hatları nicel Immunoblotting ayirt rutin doku örneklerinde biyomarker protein miktarının için doğrulamak için standart olarak

Bu çalışma, immünohistokimya için sentetik antijen kontrolleri oluşturmak için basit bir yöntemi belgelemektedir. Teknik, çok çeşitli konsantrasyonlarda çeşitli antijenlere uyarlanabilir. Numuneler, tahlil içi ve tahliller arası performansı ve tekrarlanabilirliği değerlendirmek için bir referans sağlar.

İmmünohistokimya için Sentetik Antijen Kontrolleri

Çok katlı barkodlama görüntü analizi son zamanlarda tümör mikroçevresinin karakterizasyonunu geliştirmiş ve hücre kompozisyonu, fonksiyonel durum ve hücre-hücre etkileşimleri hakkında kapsamlı çalışmalara izin vermiştir. Burada, oligonükleotid konjuge antikorların barkodlamasını ve siklus görüntülemeyi kullanarak, yüksek boyutlu bir görüntü analiz tekniğinin kullanılmasına izin veren bir boyama ve görüntüleme protokolünü tanımlıyoruz.

Parafin doku örneklerinin tek hücreli analizinde immünoprofilleme ve mekansal haritalama karakterizasyonu için çoklanmış barkodlama görüntü analizi

Bağırsak, sindirim ve emilim için hayati önem taşır. Her bölge -duodenum, jejunum, ileum, kolon- benzersiz hücresel yapılar nedeniyle farklı işlevlere hizmet eder. Bağırsak fizyolojisini incelemek, titiz bir doku analizi gerektirir. Bu protokol, İsviçre rulo tekniğini kullanarak doku fiksasyonunu ve işlenmesini ana hatlarıyla belirtir ve uygun doku koruması ve oryantasyonu yoluyla doğru immün boyamayı sağlar.

Bağırsak İsviçre ruloları ve parafine gömülü dokunun immünofloresan boyaması için optimize edilmiş protokol

Mevcut yöntem, biyopsileri ve beyin dilimleri gibi küçük, zor yönetmek için, doku parçaları, kesit tekrarlanabilir Kriyostat sağlar. Biz basit bir alüminyum donma aşamasında doku taşıma ve rutin olarak 400 mikron kalınlığında beyin dilimleri 5-10 mikron seri bölümleri üretmek için bir standart Kriyostat kolaylaştırmak için kullanır.

Dilim İmmünohistokimya için hazırlıklar İnce Kesit

Bu protokol disseke Drosophila larva immünohistokimya nasıl gerçekleştirileceği göstermektedir.

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

Keşfedin, 293T hücre hattı kullanarak immünohistokimya için formalin-sabit, parafin-gömülü hücre pelet kontrolleri oluşturma yöntemini. Bu protokol, antikor bağlanma özgüllüğünü değerlendirmede güvenilir standartlar sağlar.

Formalin-Sabit, Parafin-Gömülü Hücre Pelet İmmünohistokimya Kontrolleri için Standartlaştırılmış İşleme

Daha fazla video keşfet