Immunocytochemistry hücre parafin gömülü bloklar tarafından kültürlü hücrelerdeki Protein ifade düzeyinin belirlenmesi

Bu prosedürün genel amacı, tromboplastin-plazma hücre bloğu gömülü doku kümelerinin immünositokimyasal ve histolojik analizleri ile ilgilenilen proliferasyon belirteçlerinin ekspresyonunu analiz etmektir. Bu yöntem, dokular tarafından hücre blokajının klinik patolojisi hakkındaki anahtar soruyu cevaplamaya yardımcı olabilir. Parafin gömülü hücre bloklarının immünositokimyasal analizi için bu alternatif yöntemin temel avantajı, prosedürlerin teknik basitliğidir.

100 milimetrelik bir HeLa hücre kültürü çanağı birleştiğinde, süpernatanı FBS'siz 10 mililitre HeLa hücre kültürü ortamı ile değiştirin ve çanağı hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. 48 saat sonra, hücreleri iki mililitre PBS ile yıkayın, ardından iki mililitre% 0.25 EDTA artı tripsin içinde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte iki ila üç dakika inkübe edin. Hücreler ayrıldığında, beş mililitre tam ortam ile reaksiyonu durdurun ve hücre çözeltisini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Hücreleri santrifüjleme ile toplayın, ardından yıkama başına iki mililitre soğuk PBS'de iki yıkama yapın. İkinci yıkamadan sonra, süpernatanı bir mililitre% 95 etanol ile değiştirin ve peleti girdaplama ile karıştırın. Ardından sabit hücreleri buzun üzerine yerleştirin.

Bir parafin hücre bloğu hazırlamak için, sağlıklı donör kanından EDTA plazması topladıktan sonra, numuneleri santrifüjleyin ve 200 ila 400 mikrolitre süpernatan plazma alikotunu ayrı mikrofüj tüplerine aktarın. Daha sonra sabit HeLa hücrelerine yaklaşık 200 mikrolitre plazma, yaklaşık 200 mikrolitre tromboplastin ve yaklaşık 200 mikrolitre 025 molar kalsiyum klorür ekleyin. Karışımların oda sıcaklığında on dakika boyunca hücre pıhtıları oluşturmasına izin verin, ardından pıhtıları bir mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve ikinci yıkamadan sonra pıhtıları tek tek formalin nemlendirilmiş filtre kağıdı parçalarına tamamen boşaltın.

Pıhtıları filtre kağıdına sarın ve bezleri diğer dört formalinle nemlendirilmiş kağıt parçasının ortasındaki ayrı doku kasetlerine yerleştirmek için bir pim seti kullanın. Daha sonra doku kasetlerini, dört santigrat derecede gece boyunca formalin fiksasyonu için 50 mililitre tamponlu formalin içeren cam kavanozlara yerleştirin. Ertesi sabah, gece boyunca suyun giderilmesi ve sabit hücre koşullandırma için kasetleri bir doku işlemcisine yükleyin.

İşleme prosedürünün bitiminden en az bir saat önce, parafini eritmek için ısıtılmış bir gömme istasyonunu açın. Gömme istasyonu ve pıhtı hazır olduğunda, metal kalıpta erimiş parafin varlığını onaylayın ve oluşan bir hücre pıhtısını parafine aktarın. Metal kalıba kapaksız yeni bir doku kaseti yerleştirin ve kaseti daha fazla erimiş parafin ile kaplayın.

Parafinin soğuk bir tabakta 30 ila 60 saniye katılaşmasına izin verin. Ardından doku kasetini metal kalıptan ayırın. İmmünositokimyasal analiz için bölümler hazırlamak için, hücre pıhtısını bir parafin hücre bloğuna yerleştirin ve bloğu üç ila dört mikrometre kalınlığında dilimler halinde kesmek için bir mikrotom kullanın.

Parafin bölümlerini tuzlu su kaplı cam slaytların üzerine yerleştirin ve slaytları 30 dakika boyunca 37 santigrat derece fırına koyun. Bölümler slaytlara yapıştığında, slaytları dört dakika boyunca 15 mililitre ksilen içinde parafinden arındırın, ardından bölümlerin sıralı iki dakikalık azalan etanol inkübasyonları ile dehidrasyonu yapılır. % 80 etanol inkübasyonundan sonra, bölümleri 10 dakika akan suda durulayın ve slaytları 40 mililitre tris-EDTA geri alma tamponu içeren bir kavanozda 30 dakika kaynatın.

İnkübasyonun sonunda, antijen alınan slaytları akan su altında yıkayın ve ardından dört santigrat derecede% 95 etanol içinde 10 dakikalık bir inkübasyon yapın. Havayla kuruduktan sonra, her slayttaki hücre boyama alanını çevrelemek için hidrofobik bir kalem kullanın. Slaytları TBS-T'de yıkayın ve ardından kalan peroksidaz aktivitesini gidermek için oda sıcaklığında 15 dakika boyunca hidrojen peroksit bloğunda inkübe edin.

Slaytları TBS-T'de her yıkamada iki dakika boyunca üç kez yıkayın, ardından bölümleri bir saat boyunca ilgilenilen immünositokimyasal boyama kitinden 100 mikrolitre primer antikor karışımı ile etiketleyin ve ardından beş adet iki dakikalık TBS-T yıkaması yapın. Son yıkamadan sonra, kitten primer antikor arttırıcıdaki slaytları karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyon için son yıkamadan sonra yaban turpu peroksidaz ile etiketlenmiş yaklaşık 200 mikrolitre ikincil antikor ekleyerek bölümleri TBS-T'de dört kez yıkayın.

Geliştirilmiş bölümleri taze TBS-T'de beş kez yıkayın ve ardından üç dakika boyunca bölüm başına 100 mikrolitre diaminobenzidin çözeltisi ekleyin. Slaytları TBS-T'de iki kez yıkayın ve bölümleri bir dakika boyunca 100 mikrolitre hematoksilen çözeltisi ile etiketleyin. Daha sonra slaytları TBS-T'de bir kez daha yıkayın ve slaytları %95 etanol içinde iki dakika inkübe edin, ardından taze %95 etanole bir dal ve %100 etanole iki daldırın.

Etanol ile kurutulmuş bölümleri 40 mililitre ksilen içinde bir cam kavanozda beş dakika inkübe edin ve slaytların kurumasına izin verin. Daha sonra her slaytın üzerine bir kapak astarı monte edin ve numuneleri ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Parafine gömülü dokunun hematoksilen ve eozin boyaması, az önce gösterildiği gibi, çoğunlukla dokunma çekirdeğinde ve sitoplazmada ortaya çıkar ve bu yöntemle hücre örneklerinin mükemmel bir morfolojik şekilde korunduğunu düşündürür.

Bununla birlikte, kötü hazırlanmış hücre blokları, numuneler düzgün bir şekilde boyansa bile zayıf bir morfoloji ve düzensiz etiketleme sergiler. Hücre iskeleti ile ilişkili protein iki tipik olarak yoğunlaştırılmış kromatin, mitotik iğ ve sitoplazma içinde gözlenir. Sadece yoğunlaştırılmış kromatinde hücre iskeleti ile ilişkili protein iki boyanması olan hücreler mitotik hücrelerdir, oysa az sayıda hücre iskeleti ile ilişkili protein iki pozitif hücre serum açlığı çeken HeLa hücre kültürü popülasyonu içinde bulunur.

Yüksek mitotik HeLa hücrelerinin çoğu aynı zamanda Ki-67 pozitiftir ve hücre çekirdeğinde Ki-67 boyanması görülür. Serum açlığı çeken HeLa hücrelerinin sadece yarısı bu proliferasyon belirtecini eksprese eder. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa altı saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü denerken, iyi bir pıhtı yapmak için hücreleri uygun bir yoğunluğa seyreltmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, senkronizasyon sırasında hücre döngüsü aşaması hakkında ek soruları yanıtlamak için sabit hücrelerin akış sitometrik analizi gibi başka bir yöntem gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra, bu teknik, kültürlenmiş hücrelerdeki morfolojik bilgileri korurken hücre hattında ekspresyon profilini keşfetmek için karaciğer patolojisi alanında bir geleceğin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, immünositokimyanın nasıl yapılacağı ve kültürlenmiş hücrelerden plazma tromboplastin bloklarının nasıl hazırlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Ksilen gibi tehlikeli reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.