Name: Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu, (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-17T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: Keşfedin hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon yöntemini, Anopheles sivrisineklerinin anten ve maksiller palplerinde kemosensoryal reseptör genlerinin ifadesini görselleştirmek için. Bu teknik, sivrisinek davranışlarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Margo Herre ve Leslie Vosshall laboratuvarına, Aedes aegypti koku uzantıları için yerinde hibridizasyon protokollerini paylaştıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri'nden C.J.P.'ye (NIAID R01Al137078), HHMI Hanna Gray'in JIR'a bursu, JIR'ye Johns Hopkins Doktora Sonrası Hızlandırıcı Ödülü ve Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü Doktora Sonrası Bursu'na verilen hibelerle desteklenmiştir. Johns Hopkins Sıtma Araştırma Enstitüsü ve Bloomberg Philanthropies'e destekleri için teşekkür ederiz.

1. Dikkat edilmesi gerekenler ve materyallerin hazırlanması
<ol><li>Dokunun tam montajının mı yoksa kriyo kesitinin mi uygun olacağına karar verin. Bu protokol, Anofel sivrisinek anteni ve maksiller palp'taki RNA'nın kriyo-kesit olmadan tam montajlı in situ görüntülenmesi için optimize edilmiştir. Numuneler 5 mm'den daha kalınsa, prob penetrasyonunu sağlamak için kriyo-kesit alınması önerilir.</li>
	<li>İlgilenilen genleri tanımlayın ve intronlar ve ekzonlar dahil olmak üzere dizileri uygun bir veritabanından kopyalayın. Sentez için gen dizisini RNA'ya kopyalayın.</li>
	<li>Probların ticari satıcılardan satın alınıp alınmayacağını veya probların laboratuvarda sentezlenip sentezlenmeyeceğini belirleyin. NOT: Bu çalışmada, in situ problar ticari bir satıcıdan satın alınmıştır (bkz. Alternatif olarak, daha önce bildirildiği gibisentezlenebilir 10. Çalışmada kullanılan reaktifler Tablo 1'de açıklanmıştır. Reaktifleri hazırlamak için gerekli malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.</li>
</ol>2. Doku ön fiksasyonu
<ol><li>Yaşları 5-10 gün arasında değişen 10-15 adet erişkin dişi veya erkek Anopheles coluzzii sivrisineğini (N'Gousso suşu) ağız aspiratörü ile bir kağıt bardağa veya plastik tüpe toplayıp içinde buz bulunan bir kovaya koyarak uyuşturun. Sivrisinekler hareketsiz olduğunda başarılı bir soğuk kaynaklı anestezi doğrulanabilir.</li>
	<li>Bir çift forseps ile boyun bölgesinden kafaları çıkararak başlarını ayırın. Baskın olmayan eli kullanarak göğüs kafesini forseps ile kavrayın ve baskın elin tuttuğu forseps ile boynu vücuttan ayırın. Kafaları buz üzerinde 500 μL kitinaz-kimotripsin dimetil sülfoksit tamponu (CCD tamponu) içeren 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin. NOT: Donan hayvanlar antenleri deforme edebilir; Buz üzerinde hızlı bir şekilde devrilmesi önerilir. Test sırasında sivrisineğin yaşı projeye bağlı olarak değişebilir. Kanla beslenip beslenmedikleri, aç bırakılıp bırakılmadıkları veya çiftleşip çiftleşmedikleri gibi fizyolojik durumlarını doğrulamak ve koordine etmek önemlidir. Bu çalışmada, kanla beslenen ve çiftleşen sivrisineklerden koku uzantıları örneklendi.</li>
	<li>Sivrisinek kafalarını CCD tamponunda 37 ° C'de bir ısı bloğunda 5 dakika önceden ısıtın ve ardından sivrisinek başlıklarını içeren tüpü bir hibridizasyon fırınına aktarın ve 37 ° C'de döndürün CCD tamponunda inkübasyon süresi doku tipine bağlıdır. Dişi Anofel antenleri için 20 dakika, erkek antenler 15 dakika gerektirirken, maksiller palplar için daha uzun inkübasyon süresi (1 saat) gerekir.</li>
	<li>Tüpün tüm içeriğini diseksiyon yapan bir saat camına aktarın. Numuneyi yavaşça bir saat (diseksiyon) camının çöküntüsüne dökün. Sivrisinek kafaları tüpün içine sıkışmışsa, tüpe CCD tamponu eklemek için bir pipet kullanın ve kafayı durulayın.</li>
	<li>İnkübasyon sırasında ayrılan kafaları veya herhangi bir anteni/avuç içini dikkatlice aktarmak için forseps kullanın ve ön fiksatifin 1 mL'sine sabitleyin. NOT: Artık CCD tamponu -20 ° C'de korunabilir, tampon 3x'e kadar tekrar kullanılabilir. Ön fiksatif, dokular tarafından CCD tamponunun taşınması nedeniyle hafif kahverengimsi hale gelirse, başka bir 1 mL fiksatif ile değiştirin.</li>
	<li>Bir nutatör kullanarak kafaları 24 saat boyunca 4°C'de ön fiksatifte döndürün. NOT: Bu çalışmada kullanılan nutator için sallanma hızı ayarlanamamıştır; Üretici tarafından ayarlanan varsayılan hız (12 rpm) kullanıldı.</li>
</ol>3. Doku diseksiyonu
<ol><li>Başlıkları 4x (yıkama başına 5 dakika) buz üzerinde 1 mL %0.1 PBS-Tween ile durulayın. Numune kaybını önlemek için, sıvıyı çıkarmak için jel yükleme ucuna bağlı bir pipet kullanın. NOT: Adım 3.1 yerine iki hızlı yıkama, ardından 10 dakika uzunluğunda yıkama ve son bir hızlı yıkama gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Tüpteki kafaları bir diseksiyon saat camına aktarın. Numuneyi yavaşça bir saat camının çöküntüsüne dökün. Tüpün içine sıkışmış sivrisinek başlıklarını %0.1 PBS-Tween ile durulayın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, ilgilenilen dokuları (antenler / avuç içleri) keskin forseps ile kafadan çıkarın. Başın arka kısmını forseps ile tutun ve tabandan başka bir forseps ile bir anten alın. Forsepsleri RNAse içermeyen çözücü ile nemlendirilmiş kağıtla temizleyin. Aynı işlemi kullanarak avuç içlerini çıkarın.</li>
	<li>Antenleri ve avuç içlerini forseps ile buz üzerine yerleştirilmiş boş DNA/RNaz içermeyen tüplere aktarın. Farklı doku parçalarını önceden etiketlenmiş farklı tüplere ayırın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 1 saat boyunca metanol (MeOH% 80) ve Dimetil sülfoksit (DMSO% 20) karışımı içeren 400 μL çözücü içinde dokuyu kurutun. NOT: Bir nutatör üzerine doku yerleştirmeye gerek yoktur; Laboratuvar tezgahında oda sıcaklığında bir tüp rafına oturmasına izin verin. Taze solvent karışımı kullanılması tavsiye edilir. 500 μL'lik bir stok çözeltisi için 400 μL MeOH'yi 100 μL DMSO ile karıştırın.</li>
	<li>Dehidrasyon reaktifini 400 μL mutlak (%100) metanol ile değiştirin ve dokuları gece boyunca -20 °C'de kurutun. Dokuların yerçekimi ile yerleşmesine izin verin ve sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanın. NOT: Numuneler uzun süreli dehidrasyon için uygundur, sinyal kaybı olmadan 4 geceye kadar test edilmiştir.</li>
</ol>4. Doku sonrası fiksasyon
<ol><li>Dokuları dört aşamalı bir dizi dereceli 400 μL MeOH / PBS-Tween'de buz üzerinde 10 dakika boyunca rehidre edin. %75 MeOH/%25 PBS-Tween ile başlayın, ardından %50 MeOH/%50 PBS-Tween, ardından %25 MeOH/%75 PBS-Tween ve son olarak %100 PBS-Tween ile başlayın. NOT: Dokuları kaybetmemek için tamponu tüpten çıkarmak için küçük bir açıklığa sahip bir jel yükleme ucu kullanılabilir. Tampon çıkarma işlemi diseksiyon mikroskobu altında yapılabilir.</li>
	<li>%0,1 Tween-20 (PBS-T) içeren 400 μL fosfat tamponlu salin ile oda sıcaklığında 10 dakika yıkayın. Numuneyi bir nutatör üzerine yerleştirerek yıkayın.</li>
	<li>20 μg/mL Proteinaz-K çözeltisi yapın ve 400 μL Proteinaz-K çözeltisi içinde oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. NOT: 20 mg / mL Proteinaz-K stoğunu (1000x stok çözeltisi) seyreltin, yani 2 mL% 0.1 PBS-Tween'de 2 μL. Kalan -20 ° C'lik bir dondurucuda saklanabilir.</li>
	<li>400 μL% 0.1 PBS-tween ile 10 dakika boyunca 2x yıkayarak dokunun enzimatik sindirimini durdurun.</li>
	<li>400 μL post-fiksatif ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 400 μL %0,1 PBS-Tween ile yıkama başına 3 kez, 15 dakika yıkayın.</li>
</ol>5. Prob hibridizasyonu,
<ol><li>Dokuyu 400 μL prob hibridizasyon tamponunda 5 dakika inkübe edin. Hafifçe pipetleyerek dokunun tampona tamamen daldırıldığından emin olun.</li>
	<li>Bir dizi prob hibridizasyon tamponunu 30 dakika boyunca 37 ° C'ye ısıtarak bir sonraki adıma hazırlanın.</li>
	<li>Tamponu çıkarın ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca 400 μL önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponu ile ön hibridize edin.</li>
	<li>8 pM prob ekleyerek hedef kemosensör reseptörleri (IR8a, IR76b, IR25a, IR41t.1, IR75d, IR7t, IR64a veya Orco) için prob çözeltisi yapın. 500 μL önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponuna 8 μL 1 μM prob stoğu ekleyin.</li>
	<li>Önceden ısıtılmış prob hibridizasyon tamponunu çıkarın ve 400 μL ısıtılmış prob çözeltisi ile değiştirin.</li>
	<li>Bir inkübatörün içine yerleştirilmiş ve bir kutunun altına örtülmüş bir nutatör üzerinde iki gece boyunca 37 ° C'de doku inkübe edin.</li>
</ol>6. Prob amplifikasyonu
<ol><li>Prob yıkama tamponunu 37 ° C'ye ısıtın Dokuyu yıkama başına 5x, 10 dakika, 37 ° C'de 400 μL prob yıkama tamponu ile durulayarak, inkübatörde nutlayarak fazla prob çözeltisini çıkarın. NOT: Adım 6.4 için hazırlık başlayabilir. Adım 6.4'teki nota bakın.</li>
	<li>Numuneleri oda sıcaklığında %10 Tween-20 (SSCT) içeren 400 μL 5x salin-sodyum sitrat ile yıkama başına 2x, 5 dakika yıkayın. Amplifikasyon tamponunu bir tezgah üstünde oda sıcaklığına çözdürün.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 μL amplifikasyon tamponu ile inkübe ederek dokuyu amplifikasyon için hazırlayın. Amplifikasyon tamponunun viskozitesi nedeniyle, dokular tamamen suya batırılmayabilir. Amplifikasyon tamponunu dokunun altına nazikçe pipetleyerek ve tamponu suya batırılana kadar dokunun üstüne atarak karıştırın.</li>
	<li>6 μL 3 μM stoğu 95 °C'de 90 saniye ısıtarak ve karanlık bir çekmecede 30 dakika oda sıcaklığına soğutarak 18 pM firkete h1 ve 18 pM firkete h2'yi ayrı ayrı hazırlayın. Bir termal döngüleyicide ısıtırken saç tokalarının buharlaşmasını önlemek için PCR tüplerinin sıkıca kapatıldığından emin olun. NOT: Zaman kazanmak için, adım 6.1'deki 4. yıkama adımında adım 6.4 başlatılabilir. Çapraz reaksiyonu önlemek için saç tokaları ayrı ayrı ısıtılmalıdır. Saç tokaları bu adımda herhangi bir tampon ile seyreltilmemelidir. Saç tokaları, problarla birlikte prob üreticisinden satın alınabilir.</li>
	<li>Adım 6.3'te eklenen amplifikasyon tamponunu, 100 μL amplifikasyon tamponu ile birlikte ısıtılmış saç tokalarını (adım 6.4'ten itibaren) içeren bir karışımla değiştirin. Tipik bir reaksiyon 6 μL h1, 6 μL h2 ve 100 μL amplifikasyon tamponu içerecektir. NOT: Saç tokaları h1 ve h2, oda sıcaklığına soğutulduktan sonra birleştirilebilir ve daha sonra 100 μL amplifikasyon tamponuna eklenebilir. Doku örneklerinin bir tüpten diğerine aktarılmasını önlemek için, adım 6.3'teki amplifikasyon tamponu çıkarılabilir ve amplifikasyon tamponunda seyreltilmiş saç tokası karışımı ile değiştirilebilir.</li>
	<li>Dokuyu gece boyunca inkübe edin ve nutatörün varsayılan hızını kullanarak oda sıcaklığında karanlıkta nutat edin.</li>
</ol>7. Montaj dokusu örneği
<ol><li>İnkübe edilmiş dokudaki amplifikasyon tamponunu 300 μL 5x SSCT (Tween-20'de seyreltilmiş sodyum klorür-sodyum sitrat) ile seyreltin. NOT: Seyreltme, viskoziteyi azaltmaya yardımcı olur ve amplifikasyon tamponunun dokudan çıkarılmasını kolaylaştırır. Hücre zarını geçirgen hale getirmek için ajanlar olarak eylemlerindeki farklılıklar nedeniyle ön fiksatif için Triton-X 100 ve fiksasyon sonrası adım için Tween-20 kullandık.</li>
	<li>Dokuyu oda sıcaklığında 400 μL 5x SSCT ile 5x yıkayın. NOT: Gerekirse, mendili takılmaya hazır olana kadar geçici olarak 4 °C'de saklayın. Görüntülemeden önce 2 günü geçmedik.</li>
	<li>Bir cam slayt üzerine 5 damla montaj çözeltisi yapın. 200 μL'lik bir pipet ucunun ucunu daha geniş hale getirmek için kesin ve dokuyu yeni bir cam slayta aktarın.</li>
	<li>Doku örneklerini forseps ile tabanlarından tutun ve bir dizi montaj solüsyonu damlacığına hafifçe daldırın ve durulayın. Bu adımda dokuları kırmamaya dikkat edin.</li>
	<li>Montaj solüsyonu ile monte edin, lamel yerleştirin ve oje ile kapatın. Konfokal mikroskop kullanarak in situ doku örneklerini görüntüleyin.</li>
</ol>

Sivrisinek Koku Eklerinde Kemosensoriyel Gen Ekspresyon Haritalaması

<ol><li>Konopka, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfaction+in+Anopheles+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Senses%22%5BJournal%5D)">Olfaction in Anopheles mosquitoes.</a> Chem Senses. 46, (2021).</li>
<li>Raji, J. I., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+ionotropic+receptors+in+human+host-seeking+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes.</a> Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).</li>
<li>Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technical+review+and+guide+to+RNA+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization.</a> PeerJ. 8, e8806(2020).</li>
<li>Herre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-canonical+odor+coding+in+the+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Non-canonical odor coding in the mosquito.</a> Cell. 185 (17), 3104-3123.e28 (2022).</li>
<li>Raji, J. I., Konopka, J. K., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spatial+map+of+antennal-expressed+ionotropic+receptors+in+the+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A spatial map of antennal-expressed ionotropic receptors in the malaria mosquito.</a> Cell Rep. 42 (2), 112101(2023).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmable+in+situ+amplification+for+multiplexed+imaging+of+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Programmable in situ amplification for multiplexed imaging of mRNA expression.</a> Nat Biotechnol. 28 (11), 1208-1212 (2010).</li>
<li>Choi, H. M. T., Beck, V. A., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+higher+gain%2C+lower+cost%2C+greater+durability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Next-generation in situ hybridization chain reaction: higher gain, lower cost, greater durability.</a> ACS Nano. 8 (5), 4284-4294 (2014).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Third-generation+in+situ+hybridization+chain+reaction%3A+multiplexed%2C+quantitative%2C+sensitive%2C+versatile%2C+robust%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Third-generation in situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust.</a> Development. 145 (12), dev165753(2018).</li>
<li>Schwarzkopf, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+chain+reaction+enables+a+unified+approach+to+multiplexed%2C+quantitative%2C+high-resolution+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hybridization chain reaction enables a unified approach to multiplexed, quantitative, high-resolution immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Development. 148 (22), dev199847(2021).</li>
<li>Choi, H. M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+a+multiplexed+zoo+of+mRNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mapping a multiplexed zoo of mRNA expression.</a> Development. 143 (19), 3632-3637 (2016).</li>
<li>Pitts, R. J., Derryberry, S. L., Zhang, Z., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variant+ionotropic+receptors+in+the+malaria+vector+mosquito+Anopheles+gambiae+tuned+to+amines+and+carboxylic+acids%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Variant ionotropic receptors in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae tuned to amines and carboxylic acids.</a> Sci Rep. 7, 40297(2017).</li>
<li>Rinker, D. C., Zhou, X., Pitts, R. J., Rokas, A., Zwiebel, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antennal+transcriptome+profiles+of+anopheline+mosquitoes+reveal+human+host+olfactory+specialization+in+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Antennal transcriptome profiles of anopheline mosquitoes reveal human host olfactory specialization in Anopheles gambiae.</a> BMC Genomics. 14, 749(2013).</li>
<li>Maguire, S. E., Afify, A., Goff, L. A., Potter, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-receptor-mediated+regulation+of+chemosensory+gene+expression+in+the+malaria+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Odorant-receptor-mediated regulation of chemosensory gene expression in the malaria mosquito Anopheles gambiae.</a> Cell Rep. 38 (10), 110494(2022).</li>
<li>Athrey, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+gene+expression+in+olfactory+organs+of+the+anthropophilic+Anopheles+coluzzii+and+zoophilic+Anopheles+quadriannulatus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Chemosensory gene expression in olfactory organs of the anthropophilic Anopheles coluzzii and zoophilic Anopheles quadriannulatus.</a> BMC Genomics. 18 (1), 751(2017).</li>
<li>Task, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemoreceptor+co-expression+in+Drosophila+melanogaster+olfactory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Chemoreceptor co-expression in Drosophila melanogaster olfactory neurons.</a> eLife. 11, e72599(2022).</li>
<li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+RNA+detection+at+depth+by+hybridization+chain+reaction+and+tissue+hydrogel+embedding+and+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Single-molecule RNA detection at depth by hybridization chain reaction and tissue hydrogel embedding and clearing.</a> Development. 143 (15), 2862-2867 (2016).</li>
<li>Trivedi, V., Choi, H. M. T., Fraser, S. E., Pierce, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidimensional+quantitative+analysis+of+mRNA+expression+within+intact+vertebrate+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Multidimensional quantitative analysis of mRNA expression within intact vertebrate embryos.</a> Development. 145 (1), dev156869(2018).</li>
<li>Herre, M., Greppi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+in+situ+hybridization+and+immunohistochemistry+to+visualize+gene+expression+in+peripheral+chemosensory+tissues+of+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">RNA in situ hybridization and immunohistochemistry to visualize gene expression in peripheral chemosensory tissues of mosquitoes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2023 (1), 48-54 (2023).</li>
<li>Marx, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+of+the+Year%3A+spatially+resolved+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Method of the Year: spatially resolved transcriptomics.</a> Nat Methods. 18 (1), 9-14 (2021).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR), birkaç RNA hedefini görselleştirme konusundaki duyarlılığı ve sağlamlığı ile dikkat çekicidir8. HCR WM-FISH, Drosophila, tavuk, fare ve zebra balığı embriyolarının yanı sıra nematod ve zebra balığılarvalarında başarıyla kullanılmıştır 10,16,17. Sivrisinek antenleri ve maksiller palplar tipik olarak yüksek otofloresan ve zayıf prob penetrasyonuna...

Anopheles gambiae gibi sivrisinek vektörleri, karmaşık bir kimyasal dünyada gelişmek ve insan konakçılardan yayılan davranışsal olarak ilgili kokuları tanımlamak, nektar kaynaklarını tespit etmek ve yumurtlama bölgelerini bulmak için periferik koku uzantılarında ifade edilen zengin bir kemosensör gen repertuarına güvenir1. Sivrisinek anteni ve maksiller palp, bu koku uzantılarında koku algılamayı sağlayan kemosensör genlerle zenginleştirilmiştir. Üç ana ligand kapılı iyon kanalı sınıfı, sivrisineklerin koku alma uzantılarında koku algılamayı sağlar: zorunlu bir Koku reseptörü ko-reseptörü (Orco) ile işlev gören Koku reseptörleri (OR'ler); bir veya daha fazla IR koreseptörü (IR8a, IR25a ve IR76b) ile etkileşime giren İyonotropik reseptörler (IR'ler); karbondioksiti (CO2) tespit etmek için üç proteinden oluşan bir kompleks olarak işlev gören kemosensoriyel Tat reseptörleri (GR'ler)1,2.
RNA floresansı in situ hibridizasyon, endojen mRNA3'ün ekspresyonunu tespit etmek için güçlü bir araçtır. Genel olarak, bu yöntem, bir hedef mRNA'yı tamamlayıcı diziye sahip florofor etiketli tek sarmallı bir nükleik asit probu kullanır. Floresan RNA probunun hedef RNA'ya bağlanması, ilgilenilen bir transkripti ifade eden hücrelerin tanımlanmasına izin verir. Son gelişmeler artık tam monteli sivrisinek dokularındatranskriptlerin saptanmasını mümkün kılmaktadır 4,5. Birinci nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu (HCR) teknolojisi, RNA tabanlı bir HCR amplifikatörü kullandı; bu, bunun yerine HCR amplifikatörü 6,7 için tasarlanmış DNA'yı kullanan ikinci nesil bir yöntemle geliştirildi. Bu yükseltme, sinyalde 10 kat artış, üretim maliyetinde dramatik bir düşüş vereaktiflerin dayanıklılığında önemli bir iyileşme ile sonuçlandı 6,7.
Protokolde, herhangi bir geninuzamsal lokalizasyonunu ve ekspresyonunu tespit etmek için tasarlanmış üçüncü nesil HCR tam montajlı RNA floresan in situ hibridizasyon (HCR RNA WM-FISH) yönteminin kullanımını açıklıyoruz 8,9. Bu iki aşamalı yöntem ilk olarak, ilgilenilen mRNA'ya özgü, ancak aynı zamanda bir başlatıcı tanıma dizisi içeren nükleik asit problarını kullanır; ikinci adım, floresan sinyalini yükseltmek için başlatıcı dizisine bağlanan florofor etiketli saç tokalarını kullanır (Şekil 1). Bu yöntem aynı zamanda iki veya daha fazla RNA probunun çoğullanmasına ve RNA tespitini ve nicelemeyi kolaylaştırmak için prob sinyallerinin yükseltilmesineizin verir 8. Koku eklerinde eksprese edilen kemosensör genlerin transkript bolluğu ve RNA lokalizasyon modellerini görselleştirmek, kemosensoriyel gen fonksiyonları ve koku kodlaması hakkında ilk içgörü satırını sunar.

<table><tbody><tr><td>Amplifikasyon tamponu</td><td>Moleküler Aletler Moleküler Aletler</td><td>, Inc. | Yerinde Hibridizasyon + İmmünofloresan</td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür (CaCl2) 1M&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>21115-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Kitinaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6137-50UN</td><td></td></tr><tr><td>Kimotripsin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CHY5S-10VL ve nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpü</td><td>VWR</td><td>20901-551</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>Forseps</td><td></td><td>Dumont 11251</td><td>Numara 5</td></tr><tr><td>Jel yükleme ucu</td><td>Costar</td><td>4853</td><td>1-200 &mikro; L tip</td></tr><tr><td>Saç tokaları&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td>Moleküler Aletler A.Ş. | Yerinde Hibridizasyon + İmmünofloresan</td><td>h1 ve h2 başlatıcı bölmeleri</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>IR25a probu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>Prob Seti ID: PRK149&nbsp;</td><td>AGAP010272</td></tr><tr><td>IR41t.1 prob</td><td>Moleküler Aletler</td> <td>&nbsp; Prob Seti Kimliği: PRK978</td><td>AGAP004432</td></tr><tr><td>IR64a probu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>Prob Seti Kimliği: PRK700 ve nbsp;</td><td>AGAP004923</td></tr><tr><td>IR75d probu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>Prob Seti Kimliği: PRK976</td><td>AGAP004969</td></tr><tr><td>IR76b probu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>Prob Seti Kimliği: PRI998</td><td>AGAP011968</td></tr><tr><td>IR7t probu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>Prob Seti Kimliği: PRL355</td><td>AGAP002763</td></tr><tr><td>IR8a probu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>Prob Seti Kimliği: PRK150</td><td>AGAP010411</td></tr><tr><td>LoBind Tüpleri</td><td>VWR</td><td>80077-236</td><td>0.5 mL DNA/RNA LoBind Tüpleri</td></tr><tr><td>Magnessium Klorür (MgCl2) 1M</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>A412-500</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Thermo Fisher</td><td>43-879-36</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>Denville Scientific</td><td>Model 135</td><td>3-D Mini rocker</td></tr><tr><td>Orco probu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>Prob seti ID PRD954</td><td>AGAP002560</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (%20) Elektron</td> <td>Mikroskobu Hizmetleri&nbsp;</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (10X PBS)</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Prob hibridizasyon tamponu</td><td>Moleküler Aletler</td><td>https://www.molecularinstruments.com/</td> <td>50 mL</td></tr><tr><td>Prob yıkama tamponu</td><td>Moleküler</td><td>Aletler Moleküler Aletler, Inc. | Yerinde Hibridizasyon + İmmünofloresan</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Proteinaz-K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>Salin-Sodyum Sitrat (SSC) 20x&nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>15-557-044</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade Diamond</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>S36972</td><td>montaj çözeltisi</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür (NaCl) 5M</td><td>Invitrogen</td><td>AM9760G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp; (%10)</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (%10</td>) <td>Teknova</td><td>T0027</td><td></td></tr><tr><td>Saat camı</td><td>Carolina</td><td>742300</td><td>&nbsp; 1 5/8" kare; saydam</td></tr></tbody></table>

hibridizasyon zincir reaksiyonu rna tam montajlı floresan sivrisinek koku alma eklerinde kemosensoriyel genlerin in situ hibridizasyonu,

Hybridization Chain Reaction RNA Whole-Mount Fluorescence In situ Hybridization of Chemosensory Genes in Mosquito Olfactory Appendages

Sivrisinekler ölümcül hastalıkların etkili vektörleridir ve koku alma eklerinde eksprese edilen kemosensör reseptörlerini kullanarak kimyasal çevrelerinde gezinebilirler. Kemosensoriyel reseptörlerin periferik koku alma eklerinde uzamsal olarak nasıl organize edildiğini anlamak, sivrisinek koku alma sisteminde kokunun nasıl kodlandığına dair içgörüler sunabilir ve sivrisinek kaynaklı hastalıkların yayılmasıyla mücadele etmenin yeni yollarını bilgilendirebilir. Üçüncü nesil hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun (HCR RNA WM-FISH) ortaya çıkışı, çoklu kemosensoriyel genlerin uzamsal haritalanmasına ve eşzamanlı ekspresyon profiline izin verir. Burada, Anofel sivrisinek anteni ve maksiller palp üzerinde HCR RNA WM-FISH gerçekleştirmek için aşamalı bir yaklaşım açıklıyoruz. Bu tekniğin duyarlılığını, iyonotropik koku alma reseptörlerinin ekspresyon profilini inceleyerek araştırdık. Tarif edilen HCR WM-FISH tekniğinin, RNA problarını spektral olarak farklı üç florofora bağlayarak çoğullanmış çalışmalar için uygun olup olmadığını sorduk. Sonuçlar, HCR RNA WM-FISH'in anten ve maksiller palp koku alma uzantılarındaki çoklu kemosensör genleri aynı anda tespit etmek için sağlam bir şekilde duyarlı olduğuna dair kanıt sağladı. Daha ileri araştırmalar, HCR WM-FISH'in ikili ve üçlü RNA hedeflerinin birlikte ekspresyon profilinin çıkarılması için uygunluğunu doğrulamaktadır. Bu teknik, modifikasyonlarla uygulandığında, diğer böcek türlerinin koku alma dokularında veya diğer uzantılarda ilgilenilen genleri lokalize etmek için uyarlanabilir.

Anopheles anteninde kemosensör genlerin sağlam tespiti Sivrisinek koku dokularında kemosensör reseptörlerinin ekspresyonunu saptamak için HCR FISH yönteminin (Şekil 1) duyarlılığını araştırdık. Dişi Anofel sivrisinek anteninde daha önce bildirilen RNA transkript verilerinin rehberliğinde, çeşitli IR'leri hedeflemek için problar ürettik. Dört bağımsız anten transkriptom çalışmasından elde edilen ortalama transkript değerleri, Ir41t.1 (11 RPKM), Ir75d (12 ...

Makale, sivrisinek anteni ve maksiller palptaki kemosensoriyel reseptör genlerinin uzamsal ve hücresel çözünürlüğüne ilişkin içgörüleri ortaya çıkarmak için hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon (HCR, RNA, WM-FISH) gerçekleştirmek için gerekli yöntemleri ve reaktifleri açıklamaktadır.

Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu,

Mosquitoes are effective vectors of deadly diseases and can navigate their chemical environment using chemosensory receptors expressed in their olfactory ...

Grubumuz sivrisineklerin kemo-duyusal sistemi ile ilgilenmektedir. Bir sivrisineğin tat ve koku alma duyusunu hedef alarak, bizi bulmasını ve ısırmasını engelleyebileceğimizi umuyoruz. Hibridizasyon zincir reaksiyonu floresan in situ hibridizasyon yeni bir gelişmedir.Bu teknoloji son derece hassas, sağlam ve birkaç gen hedefini çoğullama yeteneğine sahiptir, böylece bu genlerin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu kendi doğal ortamlarında aynı anda görselleştirebiliriz. Özel transkriptomik, uzamsal biyoloji alanında kullanılan son teknoloji bir yöntemdir. Bu teknoloji, binlerce geni çoğullama yeteneğine sahiptir ve bu genlerin ekspresyonunu aynı anda görselleştirebilirsiniz.Protokolümüz, antendeki hangi nöronların 50 ya da daha fazla olası iyonotropik reseptörden herhangi birini ifade ettiğini doğrudan görselleştirmemizi sağlar. Bu bize, bu klasik faktör reseptörlerinin davranışlara nasıl aracılık edebileceğine dair anlayışımıza rehberlik edecek temel bir yol haritası sağlar. Anten gibi bir böceğin koku alma organlarındaki koku alma nöronları, tipik olarak koruyucu bir kitinli kabuğun içine gömülür.Bu, bu nöronlardaki koku alma reseptörü ekspresyonunu görselleştirmeyi çok zorlaştırır.

hybridization-chain-reaction-rna-whole-mount-fluorescence-situ

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Zamansal ve mekansal gen ekspresyon analizleri fonksiyonel genomik önemli bir role sahiptir. Tüm montaj...

Melezleme<em&gt; In situ</em&gt; Bezler, Yumurtalık ve Vektör Sivrisinek ve Embriyoların

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Elektrofizyolojik inceleme ile belirlendiği zaman Aedes aegypti büyük tat uzantıları gen ekspresyonunu değerlendirmek için iki yöntem kullanılarak,, varsayım olarak, acı ve itici bileşikler, nöronal yanıtları altında yatan genlerin dizi belirledik.

Fizyolojik Kayıtlar ve Sarı-ateş Sivrisinek Tat Çıkıntılara RNA Sıralama Aedes aegypti

Bu yazıda, özellikle digoxigenin (DIG) etiketli veya biotin etiketli problar kullanılarak böcek antenlerinde, düşük seviyeli Odorant Reseptör (OR) genleri ve diğer genler için yerinde hibridizasyon protokolünde ayrıntılı ve etkili bir RNA açıklanmaktadır.

Locust Antenlerinde Odorant Reseptör Genlerinin RNA ile Lokalizasyonu<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Basit anatomileri göz önüne alındığında, Anofel testisleri spermatogenezi incelemek için iyi bir sitolojik model sunar. Bu protokol, bu biyolojik süreci araştırmak için kullanılan bir teknik olan tam montajlı floresan in situ hibridizasyonun yanı sıra sperm üretiminde yer alan genlerde mutasyonları barındıran transgenik suşların fenotipini açıklar.

Anofel Sivrisineklerinde Spermatogenezi İncelemek için Tam Montajlı Floresan In Situ Hibridizasyon

Bu protokol, Drosophila melanogaster larva optik loblarında hibritizasyon zincir reaksiyon floresan in situ hibridizasyonu (HCR-FISH) gerçekleştirmek için gereken adımları açıklar. Prob tasarımı, hibritleşme, amplifikasyon ve doku montajı prosedürleri, gelişmekte olan optik lobun görselleştirilmesini kolaylaştırmak için ayrıntılı olarak hazırlanmıştır.

Gelişen Drosophila optik lobunda hibridizasyon zincirleme reaksiyonu FISH

Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Fare doku veri toplama maksimize etmek için farklı teknikler bir arada sunulmaktadır.

Lipofilik boya birleştiren In situ Hibridizasyon, İmmünohistokimya ve Histoloji

Burada, koku alma reseptör nöronlarının (ORN) çeşitlenmesinde rol oynayan moleküler mekanizmaları daha iyi anlamamızı sağlayan Drosophila antenlerinin tüm montaj immün boyama sürecini açıklıyoruz.

In Koku Reseptör Nöronlar Tüm Dağı ile immün<em&gt; Drosophila</em&gt; Anten

Keşfedin hibridizasyon zincir reaksiyonu RNA tam montajlı floresan in situ hibridizasyon yöntemini, Anopheles sivrisineklerinin anten ve maksiller palplerinde kemosensoryal reseptör genlerinin ifadesini görselleştirmek için. Bu teknik, sivrisinek davranışlarını anlamaya yardımcı olur.

Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu, (Video) | JoVE Journal

Hibridizasyon Zincir Reaksiyonu RNA Tam Montajlı Floresan Sivrisinek Koku Alma Eklerinde Kemosensoriyel Genlerin In situ Hibridizasyonu,

Daha fazla video keşfet