Plazmonik Nanotcımbız Kullanarak Tek Değiştirilmemiş Proteinlerin Konformasyonel Dinamiğinin İzlenmesi

Bu araştırma, mevcut teknikleri kullanarak araştırılması zor olan veya hastalıkla ilgisi olan proteinlere özel olarak odaklanarak, gerçek zamanlı olarak tek molekül düzeyinde etiketsiz proteinler hakkında bilgi edinmeyi amaçlamaktadır. Plazmonik nanotcımbızlar, son zamanlarda küçük moleküllere bağlandıktan sonra konformasyonel dinamikleri izleme, sökme kinetiğini kontrol etme ve serbest enerji manzaralarını tek molekül düzeyinde aydınlatma yeteneklerini göstermiştir. Şu anda, etiketsiz tek moleküllü protein konformasyonel dinamiklerini araştırabilen yerleşik bir protein karakterizasyon tekniği yoktur.

Plazmonik nanotcımbızların bu alandaki bu boşluğu doldurma potansiyeline sahip olduğuna inanılmaktadır. Bu benzersiz avantaj, proteinlerin konformasyonel değişimi ile biyolojik işlevleri arasındaki ilişkiyi ve hastalık gelişimindeki etkileri araştırmamıza yardımcı olur. Gelecekteki araştırmalar, Alzheimer, Parkinson ve çeşitli kanserler gibi çeşitli hastalıklarda rol oynadığı için, içsel olarak düzensiz ve zar proteinlerine odaklanacaktır.

Başlamak için, PEG ile kaplı numuneyi düz cımbız kullanarak 3D baskılı akış hücresine yerleştirin ve altın katmanın yukarı baktığından emin olun. Şeffaf PET plastik çift taraflı bant kapağının bir tarafını soyun. Bandı numune ve akış hücresinin üzerine dikkatlice yerleştirin ve akış hücresindeki nano yapıların ve giriş/çıkış deliklerinin açıkta kaldığından emin olun.

Yuvarlak cımbız kullanarak, akış hücresine ve numuneye yapışmasını sağlamak için bandın kenarlarına hafifçe bastırın. Bandın diğer tarafını soyun ve numunenin üzerine nazikçe bir cam kapak parçası yerleştirin. Yapışmasını sağlamak için kapak kaymasının kenarlarına bastırmak için yuvarlak cımbız kullanın.

Bu işlem, akış hücresi içinde 50 mikrometre yüksekliğinde ve 3.5 mikrolitre hacminde bir sıvı kanalı oluşturur. Küçük bir pipet ucu kullanarak, çoğaltıcı silikonun çözelti A'sını ve çözelti B'sini bire bir oranında veya üretici tarafından belirtilen bir mikroskop lamı üzerine karıştırın. Kapak lamı ile akış hücresi arasındaki boşlukları karışık bir çoğaltma silikonu ile doldurun ve yavaşça kapak fişinin altına itin.

Akış hücresini baş aşağı tutun ve deliğin iç duvarının etrafına çoğaltma silikonunu dikkatlice uygulayın. Silikonu, numunenin alt tarafındaki erimiş silikanın görünür kenarlarına yavaşça hareket ettirin ve numuneyi, çoğaltan silikon tamamen sertleşene kadar altın tabaka yukarı bakacak şekilde kurumaya bırakın. Tüm bileşenlerin doğru şekilde bağlandığını doğruladıktan sonra, mikroakışkan sistem kullanıcı arayüzünü bilgisayara yükleyin.

İlgili arayüzlerini açmak için sırasıyla 12'ye bir döner valfi ve üçe iki valfi kontrol eden MUX dağıtıcısının ve telinin yanındaki oynat simgesine tıklayın. Üçe iki vanayı atlamak için, telin birinci portunu açın. Akış hücresini plazmonik nano cımbızlara monte etmek için, giriş ve çıkış tüplerini akış hücresinin uygun kısımlarına takın.

Akış hücresini, altın tabakası yukarı bakacak şekilde temiz doku üzerine yerleştirin. Tamponu akış hücresine dakikada yaklaşık 0,3 mililitre gibi yüksek bir akış hızında infüze edin. Sıvının akış hücresi içindeki numune boyunca hareket ettiğini ve dış veya alt tarafta hiçbir sıvının görünmediğini kontrol edin.

100X objektife bir ila iki damla daldırma yağı uygulayın. Akış hücresini, altın tabaka aşağı bakacak şekilde plazmonik nano cımbız aşamasına yerleştirin. Akış hücresini mıknatısların üzerine metal klipsler kullanarak sabitleyin ve sahneyi yerinde tutmak için kilitleyin.

Beyaz ışık kaynağını açın. Kamera yazılımını açın ve nano yapılar görünür hale gelene kadar pozlama süresini ve kazancını ayarlayın. Lazeri nispeten yüksek bir güçte açın ve lazer noktası görünene kadar Z eksenini manuel olarak ayarlayın.

Piezoelektrik kontrol cihazını açın ve iletişim portu ve maksimum voltaj için uygun ayarları seçin. Her yöne daha iyi sahne hizalaması sağlamak için X, Y ve Z ekseni değerlerini maksimum voltajın yarısına ayarlayın. Ana aşama X, Y ve Z ekseni kontrol düğmelerini kullanarak lazer noktasını çift nano delik veya DNH yapılarından biriyle hizalayın.

Çığ foto diyotunun veya APD'nin açık olduğundan emin olun. Muhafazayı plazmonik nanotcımbızlara yavaşça kapatın. Ev yapımı bir LabVIEW UI gibi APD kaydıyla ilişkili yazılımı açın. Dosya adını düzenleyin ve kesme frekansını bir kilohertz olarak ayarlayın.

Ardından, dosyaların kaydedileceği istenen dosya yolunu belirtin. Beyaz ışık kaynağını kapatın ve lazeri tekrar açın. Lazer gücünü uygun bir seviyeye ayarladıktan sonra, APD sinyali mümkün olduğu kadar yüksek olana kadar X, Y ve Z eksenlerini ayarlamak için piezoelektrik kontrolleri kullanın.

APD doygunluğundan kaçınma ve izin minimum standart sapması ile. Ardından, nano yapıların ömrünü korumak için lazeri kapatın. Valfi ayarlamak ve istenen miktarda proteini çekmek için şırınga pompası kontrol ünitesini ve distribütör kullanıcı arayüzünü çalıştırın.

Mikroakışkan kullanıcı arayüzünü kullanarak, protein çözeltisini geri çekilme hızına benzer bir akış hızında infüze edin. Protein çözeltisi akış hücresine ulaşana kadar bu hızda infüzyona devam edin. Ardından akış hızını bindirme için uygun bir değere ayarlayın ve izin stabilize olmasını bekleyin.

Şırınga pompasındaki hacim ve sürenin beklenen değerlerle eşleştiğini doğrulayın. APD sinyal verilerini kaydetmek için, piezoelektrik denetleyici kullanıcı arayüzünü kullanarak X, Y ve Z eksenlerini gerektiği gibi ayarlayın. İletim ve standart sapmada büyük bir değişiklik gözlemledikten sonra, gelecekteki veri sıralaması için bunun ne zaman gerçekleştiğini not edin. Proteinin deneyin bir parçası olarak serbest bırakılması gerekiyorsa, lazeri yaklaşık beş saniye kapatın, ardından tekrar açın.

İz, iletimde büyük bir değişikliğe ve önemli ölçüde daha düşük bir standart sapmaya sahip olmalıdır, bu da temel duruma dönüşü gösterir. Deneyi tamamladıktan sonra lazeri kapatın. Akış hücresini üç eksenli aşamadan çıkarın ve mikroakışkan sistem borusunu ayırın.

Akış hücresini, altın tabakası yukarı bakacak şekilde temiz doku üzerine yerleştirin. Bir neşter kullanarak, nazikçe kaldırmadan ve atmadan önce cam kapak astarının altındaki yapıştırıcıyı dikkatlice kesin. Akış hücresini, altın tabaka hala yukarı bakacak şekilde belirli bir açıyla tutun ve numuneyi serbest bırakmak için akış hücresinin alt tarafındaki yapıştırıcıyı dikkatlice çıkarmak için yuvarlak cımbız kullanın.

Düz cımbız kullanarak numuneyi alın ve izopropanol ile iyice durulayın. Numuneyi bir hava tabancası kullanarak kurutun. Bir apoferritin molekülüne yerinde demir yüklemesi üzerinde gerçekleştirilen temsili bir deney, plazmonik nanotcızerlerin protein konformasyonel dinamiklerini araştırmak için bir araç olarak kullanımını göstermektedir.

Apoferritinin iletim izi, bir PBS çözeltisinde sıkışıp kaldığında sabit kalır ve bu da önemli bir konformasyon değişikliği olmadığını gösterir. Demirli çözeltiye maruz kaldıktan sonra, eserin standart sapmalarındaki dalgalanmalar artmıştır, bu da demir yüklemesi ile ilişkili dinamik yapısal değişiklikleri gösterir. 20 dakikalık demir maruziyetinden sonra, iletim izi stabilize oldu ve apoferritinin holoformuna geçişini gösterdi.

Olasılık yoğunluk fonksiyonu grafikleri, demir yüklemesi üzerine voltaj dağılımında bir kayma gösterdi ve apoferritinden holoferritine konformasyonel geçişi daha da destekledi.