Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Bu prosedürün genel amacı, mekanik yükün tek proteinlerin proteolitik bölünmesi üzerindeki etkisini oldukça paralel ve uygun maliyetli bir şekilde incelemektir. Bu demonstrasyonda, kollajenin matriks metalloproteinaz bir ile bölünmesi ilk adımda incelenir, kollajen düzelticiler bir akış hücresinin cam kapak kızağına tutturulur, ardından mikrometre boyutunda manyetik boncukların tek tek kollajen moleküllerine tutturulması yapılır. İkinci adım, akış hücresini manyetik cımbız aparatına monte etmek ve özel olarak takılmamış boncukların kapak kayma yüzeyinden çıkarıldığını kontrol etmektir.

Daha sonra, proteaz akış hücrelerine eklenir. Son adım, boncuk ayrılmasını gerçek zamanlı olarak izleyerek proteoliz oranını belirlemektir. Değişen proteaz konsantrasyonlarında ve kuvvetlerinde boncuk ayrılma oranlarını ölçerek, çok az miktarda substrat ve proteaz kullanarak standart zoolojik kinetik parametreler elde etmek mümkündür.

Ek olarak, bu teknik, mekanik kuvvetin proteoliz hızı üzerindeki etkisi ve bölünmeye eşlik eden substrat proteinindeki yapısal değişiklikler hakkında benzersiz bilgiler sağlar. Bu tekniğin optik T izleri ve atomik kuvvet mikroskobu gibi diğer yöntemlere kıyasla en büyük avantajı, bu tekniğin yüksek verim ve uygun maliyetli olmasıdır. Bu yöntem, tek proteinlerin proteolitik bölünmesi üzerindeki etkili kuvvet hakkında fikir verebilse de, enstrümantasyon ve teknikler, kuvvetin protein katlanması ve doğrulanması üzerindeki etkisi de dahil olmak üzere çok çeşitli biyofiziksel problemlere uygulanabilir.

Sonikasyon kullanarak kapak fişlerini temizleyerek akış hücresi hazırlığına başlayın. Kapak fişlerini, atoryuma sığan, onları tutabilen küçük bir cam kaba ekleyin. Kabı izopropanol ile doldurun ve izopropanol 20 dakika boyunca bir banyo cihazında sonikat yapın ve kapak fişlerini bol miktarda deiyonize su ile durulayın.

Kabı suyla doldurun ve 20 dakika boyunca sonikat yapın. Sonikasyondan sonra kuru, kapak filtrelenmiş tozsuz hava akımında kayar. Kapak fişlerini inceleyin ve yalnızca leke içermeyenleri kullanın.

Kapağı geçerek kalan toz ve nemi temizlemek için kapak kızaklarını birkaç saniye hafifçe alevlendirin. Bir bunsen brülörü tarafından üretilen bir gaz alevinden kayar ve aşırı ısı nedeniyle kapak kızağının bükülmemesine dikkat eder. Bu adım, artık yüzey kirleticilerini giderir.

Ardından, iki kapak fişini birbirine yapıştırmak için çift taraflı bant kullanın. Önce bandı yaklaşık üç santimetre uzunluğunda ve 0,3 santimetre genişliğinde keserek, bandı ortada 1,6 santimetrelik bir kanal bırakarak 22 x 40 milimetrelik bir kapak kızağına takın. Bandın düzgün bir şekilde yapıştığından emin olmak için kapak fişine hafifçe bastırmak için bir pipet ucu kullanın.

Manyetik cımbız aparatı, bu laboratuvar tarafından bir milimetre çapında iğne deliğine sahip bir alüminyum L braketi kullanılarak inşa edildi ve cımbızın yüksekliğini modüle etmek için dikey bir Z tercümanı üzerine monte edildi. Manyetik alan gradyanını oluşturmak için iğne deliğinin her iki yanındaki brakete iki kalıcı nadir toprak mıknatısı bağlandı. Manyetik tuzağın uygun şekilde kalibre edilmesi bu prosedür için çok önemlidir.

Başarıyı sağlamak için, bu bölümde belirtildiği gibi iki farklı yöntem kullanıyoruz. Manyetik tuzağı kalibre etmek için: Kalibrasyon için, yazılı protokolde açıklandığı gibi biyotin ve doksijen ile beş asal ve üç asal ucunda etiketlenmiş Lambda fajından önceden hazırlanmış DNA'yı kullanın. DNA'yı önce akış hücresine bağlamak için, akış hücresini anti-D oksijen ve antikor çözeltisi ile doldurun ve antikorun 15 dakika boyunca cam yüzeye yapışmasına izin verin.

Daha sonra, akış hücresine bir BSA çözeltisi ekleyerek DNA'nın spesifik olmayan yapışmasını önlemek için akış hücresinin yüzeyini yedim. Bu asyon adımı ve sonraki tüm adımlar için, akış hücresine eklenen reaktif hacminin en az iki katı olması gerektiğini unutmayın. Bu gösteride 75 mikrolitre olan akış hücresinin hacmi, akış hücresini oda sıcaklığında 45 dakika inkübe eder.

Bu adımı tekrarladıktan sonra, 50 piko molar işlevselleştirilmiş lambda DNA'sı ekleyin ve 15 dakika boyunca kapak fişine yapışmasına izin verin, fazla DNA'yı bir XPBS ile yıkayın. Son olarak, streptavidin kaplı süper paramanyetik boncuklar ekleyin ve 15 dakika boyunca hareketsiz hale getirilmiş DNA'ya yapışmalarına izin verin. Bu gösteride 2.8 mikrometre boncuk kullanılmıştır.

Fazla boncukları bir XPBS ile yıkayın. Ardından, kalıcı mıknatısları numune yüzeyinden uzak bir konuma hareket ettirerek manyetik cımbız kalibrasyonu gerçekleştirin. Daha sonra hazırlanan akış hücresini mikroskoba yerleştirin.

Kalıcı mıknatısları akış hücresinin üzerindeki konuma getirin. Lambda DNA işlevselleştirilmiş boncukların odak düzlemini, boncuklara her iki cam yüzeyden uzağa odaklanarak seçin. Doğru odak düzlemi, istenen boncukların parlak bir merkeze sahip olduğu düzlemdir.

500 kare için 80 hertz'in daha büyük olduğu boncuk hareketinin bir videosunu çekin. Mıknatısı numune yüzeyine yaklaştırın ve her konumda boncuk hareketinin bir videosunu kaydedin. Beş milimetreyi aşan mesafeler için, bir ile beş milimetre arasındaki mesafeler için bir milimetrelik artışlarla hareket edin.

0,5 milimetrelik artışlarla hareket edin Bir milimetreden daha kısa mesafeler için 0,25 milimetrelik artışlarla hareket edin Her veri kümesi için, 2B Gauss uyumu kullanarak boncukların merkezini izleyin. Yazılı prosedürde açıklandığı gibi brown dalgalanmaları yoluyla kuvvetin hesaplanması. Kuvvet hesaplamasını bir güç spektrumu Lian fit aracılığıyla kontrol ederek kuvvetlerin doğruluğunu onaylayın.

Yuvarlanma frekansını bulmak için, uygulanan kuvvet ile yuvarlanma frekansı arasındaki ilişki, kollajen peptitin akış hücrelerine bağlanmasından önceki metinde bulunabilir, kollajen peptit ve MMP bir proteini eksprese eder ve saflaştırır. Akış hücresine anti mic antikor çözeltisini ekleyerek başlayın ve anti mic'in akış hücresinin yüzeyine yapışmasına izin vermek için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin, proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için akış hücresini yedi, mililitre başına beş miligram kullanarak. BSA: 150 pikomolar kollajen peptit ekleyin ve 45 dakika boyunca M ttag yoluyla antikora bağlanmasına izin verin.

Akış hücresine 2.8 mikrometre boncuk eklemeden önce PBS tamponu kullanarak fazla kolajeni yıkayın. Güçlü mıknatıslar kullanılarak strep divid ve kaplanmış boncuk çözeltisinden ayrılmalı, daha sonra PBS'de yeniden süspanse edilmelidir. Bu işlem üç kez tekrarlanmalıdır.

Bu adım, 2.8 mikrometrelik boncukların yüzeydeki hareketsiz kollajen peptidine bağlanmasını sağlamak için gereklidir. Daha sonra, strep divid streptavidin kaplı süper paramanyetik boncuklar ekleyin ve 45 dakika boyunca kollajen moleküllerine yapışmalarına izin verin. Akış hücresi kollajen peptit ve manyetik boncuklarla birleştirildikten sonra, akış hücresini manyetik tuzakta görüntüleyin.

Düşük kuvvet altında, boncukların bir alt popülasyonu bazen zayıftır ve yüzeye spesifik olmayan bir şekilde yapışır. Mütevazı bir kuvvetin uygulanması, bu boncukların serbest bırakılmasını sağlar. Akış hücresine aktive edilmiş enzim ekleyin.

Bu durumda, MMP bir, 3.5 milimolar A PMA eklenerek önceden aktive edildi ve üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edildi. Bir akış hücresi manyetik cımbız aparatına yeniden yerleştirilir yerleştirilmez, birkaç görüş alanını kapsayan ve tipik olarak birkaç yüz bağlı boncuk veren bir video kaydedin. Bu ölçüm sıfıra eşit zamana karşılık gelir.

Tüm boncuklar ayrılana veya daha fazla proteoliz fark edilemene kadar düzenli zaman noktalarında birkaç görüş alanı kaydetmek için aynı işlemi tekrarlayın. Manyetik cımbız bir mikrometre ve 2.8 mikrometre boncuklar için kalibre edildi. Hem gözlemlenen brown dalgalanmalarının büyüklüğünü hem de zorlanmış proteoliz deneylerinde değişen mıknatıs pozisyonlarında yuvarlanma frekansının hesaplanmasını kullanarak, kalan normalleştirilmiş boncuk sayısı, proteoliz oranını bulmak için zamanın bir fonksiyonu olarak çizilebilir.

Ve bu işlem, değişen enzim konsantrasyonları ve kuvvetleri için tekrarlanabilir. Proteoliz oranları uygulanan kuvvete bağlıdır. Proteoliz oranları bir adet Newton, 6.2 Pico Newton ve 13 adet Pico Newton olarak belirlendi.

Boncukların oranı 15 dakikadan fazladır, farklı deneylerde yaklaşık olarak 0.25'te sabit kalır. Bizim durumumuzda, tahlil, uygulanan kuvvetin bir fonksiyonu olarak MMP'nin katalitik verimliliğini ölçmemize izin verdi. Verileri analiz ederek, kollajen üçlü sarmalının proteolizden önce lokal olarak gevşemesi gerektiğini bulduk.

Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik doğru yapılırsa beş ila altı saat içinde gerçekleştirilebilir. Verilerinizin iyi bir istatistiksel anlamlılığını elde etmek için görüntüleme yakıtı başına en az 30 ila 50 boncuk gerektiğini unutmamak önemlidir. Bir PMA'nın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu deneyi gerçekleştirirken her zaman eldiven, laboratuvar önlüğü ve yüz maskesi gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.

Bu videoyu izledikten sonra, manyetik cımbız kullanarak tek proteinlerin proteolitik bölünmesi üzerindeki kuvvetin etkisini nasıl ölçeceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Manyetik cımbız, tek moleküllü biyofiziksel deneyleri anlamak için harika bir araçtır. Bu teknik, diğer proteaz ve substrat kombinasyonlarına genişletilebilir.

Ek olarak, protein yapısal dinamiklerini anlamak ve RNA ve/veya DNA'yı bağlayan veya değiştiren diğer proteinleri anlamak için benzer teknikler kullanılabilir.