Name: Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-25T11:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Öğrenin manyetik cımbız kullanarak tek molekül proteoliz ölçümlerini. Bu yöntemle mekanik yükün enzimatik aktivite üzerindeki etkisini yüksek verimli ve maliyet etkin şekilde inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Bilimsel Arabirimi (ARD), NIH Direktörü Yeni Yenilikçisi Ödülü Programı çerçevesinde Ulusal Sağlık Enstitüleri 1-DP2-OD007078 (ARD), William Bowes Jr Stanford Yüksek Lisans Bursu (ASA de Burroughs Wellcome Kariyer Ödülü ile desteklenmiştir ) ve Stanford Kardiyovasküler Enstitüsü Younger predoctoral Bursu (JC). Yazarlar mikroskopi ekipman loaning James Spudich teşekkür ederim.

1. Akış Hücre Hazırlık <ol><li> Lamelleri (# 1.5, 22x22 mm ve 22x40 mm, VWR) sonication kullanılarak temizlenir. <ol><li> Lamelleri tutarak ve (bkz: adım 2) sonikatör uyum gösterme yeteneğine sahip küçük bir cam kaba lamelleri ekleyin. </li><li> Izopropanol ile kabın doldurmak ve 20 dakika boyunca bir banyo içinde sonikatör ses dalgalarına maruz. </li><li> Izopropanol atın ve bir Barnsted MilliQ aparatı veya benzer bir cihaz tarafından üretilen deiyonize bol su ile lamelleri durulayın. Su kabı doldurun ve 20 dakika boyunca ses dalgalarına maruz. </li><li> Sonikasyon sonra, filtrelenmiş ve tozsuz bir hava akımı içinde lamelleri kurutun. (Yani hiçbir leke) temiz görünen sadece lamelleri kullanın. </li><li> Yavaşça alev birkaç saniye lamelleri kalan toz ve nem onları temizlemek için: aşırı ısı nedeniyle coverslip çarpıtmak için özen, bir Bunsen beki ile üretilen bir gaz alevi ile lamelleri geçmektedir. Bu adım artık yüzeyi temizlerkirleticiler. </li></ol></li><li> Çift taraflı seloteyip kullanarak, iki arada lamelleri takın. Bantı kesiniz ~ uzunluğu 3 cm, genişliği 0,3 cm. Ortasında 1.6 cm kanalı terk 22x40 mm coverslip üzerindeki bandı takın. Yavaşça bant yapıştırılır düzgün emin olmak için coverslip basmaya bir pipet kullanın. </li></ol> 2. Manyetik Cımbızlar Kurulum ve Kalibrasyon <ol><li> Manyetik cımbız 10,12 önceden açıklandığı gibi kalıcı nadir toprak mıknatıslar kullanarak kurulum vardı. Bir alüminyum L-braketi, 1 mm çapında iğne deliği ile inşa ve dik bir z-çevirmen (Thorlabs) cımbız yüksekliği modüle etmek için monte edildi. İki kalıcı nadir toprak mıknatıslar manyetik tuzak (Şekil 1) oluşturmak için iğne deliği her iki tarafında üzerinde dirsek bağlanmıştır. </li><li> DNA hazırlığı: 5 've 3' olarak etiketlenmiş lambda faj DNA biotin ve digoxigenin (IDT DNA, San Diego, CA) ile bitiyorsa, mag kalibre etmek için kullanılanmanyetik cımbız. <ol><li> 10 dakika boyunca 60 ° konjuge oligonükleotid ve ısı ° C biyotin 40 nM olan, 2 ul 4 nM λ-DNA 50 uL karıştırılır. 1 saatten fazla oda sıcaklığında Sonra yavaş yavaş serin. </li><li> Üreticinin talimatlarına uygun olarak DNA ligazı ekleyin ve 3 saat boyunca oda sıcaklığında ligate. </li><li> 45 dakika boyunca oda sıcaklığında 400 nM digoxigenin konjuge oligonükleotid ve inkübe 2 uL ekleyin. </li><li> 10 mM ATP 1,5 uL ekleyin ve 3 saat boyunca λ-DNA digoxigenin konjuge oligonükleotid ligasyonu devam etmektedir. </li><li> 100 kDa dönüş filtreleri (Microcon UltraCell YM-100) ile aşırı oligonükleotidler ve DNA ligaz çıkarın. TE tamponunda 1000 kat tampon değişimi toplam aşırı oligos kaldırmak için yeterlidir. Not: DNA kesme yol açacaktır çünkü dönüş hızları&gt; 500xG kullanmak önemlidir. </li><li> Bu DNA i sağlamak için bir% 0.7 agaroz jel üzerinde elektroforez yoluyla DNA'nın bir numune incelemeks doğallığından veya makaslanmış değil. </li><li> DNA konsantrasyonu ölçün. Uygun numune hacmi çok küçük olabilir, çünkü bir Nanodrop UV-Vis spektrometre (Thermo Scientific) kullanılması önerilir. </li></ol></li><li> 1. bölümde tarif edildiği gibi akış hücreleri hazırla. </li><li> Akış hücresi için DNA eki için, anti-digoxigenin antikor ekleyin (koyun IgG; 1 mg mL -1; Roche Bioscience, Manheim, Almanya) ve 15 dakika boyunca cam yüzeye yapışma sağlar. </li><li> 1x PBS içinde 2 mL -1 mg BSA,% 0.1 Tween-20 ekleyerek DNA spesifik olmayan yapışmasını önlemek için akış hücresi yüzeyinde dinginleştirmek. 45 dakika oda sıcaklığında inkübe edilir. </li><li> Adım 2.5 tekrarlayın. </li><li> Λ-DNA fuctionalized 50 pM ekleyin ve 15 dakika coverslip eklemek için izin verir. </li><li> 1x PBS ile aşırı DNA silsin. </li><li> 2,8 um boncuklar = 20 ug mL -1; streptavidin kaplı boncukların süperparamanyetik (1 um boncuklar = 2 ug mL -1 ekleme </li><li> 1x PBS ile aşırı boncuk silsin. </li><li> Manyetik Cımbızlar Kalibrasyon <ol><li> Uzağa Örnek yüzey (&gt; 15 mm) olduğu bir konuma hareket ettirmek daimi mıknatıslar. </li><li> Mikroskopta hazırlanan akış hücresi yerleştirin. </li><li> Akış hücresi üzerindeki pozisyona daimi mıknatıslar taşıyın. </li><li> Uzaklıkta cam yüzeyler hem boncuklar odaklanarak λ DNA fonksiyonlandırılmış boncuk odak düzlemi seçin. Doğru odak düzlemine istenilen boncuk parlak bir merkeze sahip olduğu biridir. </li><li> 500 kare için 80 Hz veya daha az boncuk hareket bir video çekin. </li><li> Yakın Örnek yüzeyine mıknatıs hareket eder. 5 mm aşan mesafeler için 1 mm artışlarla taşımak. 1 ve 5 mm arasındaki mesafeler için 0.5 mm artışlarla taşımak. 1 mm'den daha az mesafeler için 0,25 mm artışlarla taşımak. </li><li> Her yeni cazibe konumunda adımları 2.11.5 ve 2.11.6 tekrarlayın. </li><li> Her bir veri içinayarlamak, 2B Gauss uyum kullanarak boncuk merkezi izleyebilirsiniz. </li><li> Kullanarak Brownian dalgalanmalar yoluyla gücü hesaplayın: </li></ol><img alt="Denklem 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 1"> k B T Boltzmann termal enerji burada, L λ-DNA'nın uzunluğu, &lt;X 2&gt; sentroid pozisyonu içinde varyans. <ol start="10"><li> Rolloff frekansını bulmak için bir güç spektrumu Lorentz oturması ile kuvvet hesabı kontrol ederek güçleri doğruluğunu onaylayın. Uygulanan kuvvet ile ilişkili rolloff frekansı ile ilgilidir: </li></ol><img alt="Denklem 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 2"> F 0 rolloff frekansı olduğu, bir boncuk yarıçapı, ve μ akışkan viskozitesi 12'dir. </li></ol> 3. Akış Hücreler Kolajen Peptid Eklenti Bizim metodoloji uygulanması için somut bir örnek vermek için, biz bir trimeric kollajen modeli peptid proteoliz karakterize laboratuvarımızda son çalışmalarını açıklamak. Biz bu genel yaklaşımın genel olarak diğer proteinlerin ve polinükleotidler uygulanabilir tahmin ediyoruz. <ol><li> Kollajen modeli peptid üçlü sarmal oluşumunu zorlamak için 10 5x myc etiketi, (GPP), kollajen takip arınma, bir N-terminal 6x His-tag oluşur oluşturan α1 artıkları 772-786 (GPQGIAGQRGVVGL), MMP- 1 tanıma sitesinin, foldon sekansı (GSGYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL), ve bir C-terminali KKCK biyotin-maleimid ile etiketlenmesi kolaylaştırmak için. Foldon T4 faj protein fibritin türemiştir ve N ya da erimiş zaman kolajen modeli trimerler stabilize - ya da C-terminali 13,14. </li><li> Daha önce tarif edildiği gibi 4,15 kolajen peptid ve MMP-1 proteinleri ifade edilmiş ve saflaştırılmış edildi. &lt;/ Li&gt; </li><li> Anti-myc akış hücresi yüzeyinde bağlanmasını sağlamak için anti-myc (15 ug mL -1) 20 dakika oda sıcaklığında inkübe akış hücresi ve eklemek. </li><li> Adım 2,5 tarif edildiği gibi aynı şekilde 5 mg mL -1 BSA kullanılarak proteinlerin spesifik olmayan bağlanma önlemek için akış hücresi dinginleştirmek. </li><li> 150 pM kolajen peptid ekleyin ve 45 dakika myc etiketi aracılığıyla antikor eklemek için izin verir. </li><li> PBS tamponu kullanarak fazla kolajen silsin. </li><li> Streptavidin kaplı süperparamanyetik boncuk (1 mikron boncuklar = 2 mg mL-1 ve 2.8 mikron boncuk = 20 mg mL-1) ve onlara 45 dakika boyunca kollajen moleküllerine eklemek izin. Ekle 1 um boncuklar PBS içinde istenen konsantrasyonuna seyreltildi edilmelidir. 3 um Boncuklar daha sonra PBS ile resolubilized kuvvetli mıknatıslar, kullanarak çözeltisi ayrılmalıdır. Bu süreç, 3 defa tekrarlanır edilmelidir. Biz bu adımı ge için gerekli olduğunu farkt 3 um boncuklar yüzeyi-immobilize kolajen peptit bağlamak. </li></ol> 4. Kuvvet Proteoliz Assay <ol><li> Bir kez akış hücresi düşük, ~ 1 pN kuvvet altında manyetik tuzak görüntü akış hücresi, kolajen peptit ve manyetik boncuklar ile monte edilir. Deneyimlerimize göre, boncuklar bir alt bazen zayıf bir non-spesifik şekilde yüzeye yapıştırılır. Mütevazı kuvvetin uygulanması bu boncuklara kurtarılmış olmasını sağlar. </li><li> Akış hücresi için aktif enzim ekleyin. Bu durumda, MMP-1 3,5 mM APMA (4-aminophenylmercuric asetat) ilave edildi ve 3 saat için 37 ° C'de inkübe tarafından önceden aktive edildi. Aktivasyon SDS-PAGE kullanılarak teyit edildi. </li><li> Yakında akış hücresi manyetik cımbız cihazın içine yeniden tanıtıldı olarak, genellikle birkaç yüz ekli boncuk veren, bakış birkaç alanları kapsayan bir video kaydedebilirsiniz. Bu, t = 0 olacaktır. </li><li> T dönerken görünümü çeşitli alanlarda kayıt aynı işlemi (tekrarlayınTüm ayırmak boncuk veya başka proteoliz ayırt oluncaya kadar, normal süre noktalarda aynı görüş alanı) o. </li><li> Kinetik veri analizi <ol><li> Farklı zaman noktalarında görüş çeşitli alanlarda boncuk saymak ve onları giriyoruz. T = 0 boncuklar sayısına göre, her bir zaman noktasında boncuklar ortalama sayısına bölünmesiyle boncuklar numarası normalize. Bu boncuk mutlak sayısı deneyden deney farklı olacaktır, çünkü biz, farklı deneyler proteolizin fiyatlarını karşılaştırın sağlar. </li><li> Zamanın bir fonksiyonu olarak oranı çizilir. Bu durumda, bir üstel bozulma artı bir sabit onu donatılmış. </li></ol><img alt="Denklem 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem 3"> f (t) (ya da kollajen molekülleri unproteolyzed) eklenmiş boncuklar oranı olduğu, t zaman, bir kollajen bir kemer tutturulmuştur boncuklar fraksiyonu, b bozunma oranı sabit olduğu ve Cnon-spesifik bağlı boncuk bölümüdür. <ol start="3"><li> Aynı deney MMP-1 kollajen proteoliz üzerindeki kuvvetin etkisini aydınlatmak için kuvvet ve MMP-1 biyokatalist tekrarlanır. </li></ol></li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Yukarıda protokolü enzimatik proteoliz üzerindeki kuvvetin etkisini incelemek için manyetik cımbızları (Şekil 1) arasında yeni bir kullanımını açıklar. Biz gözlenen Brownian dalgalanmaların büyüklüğü ve değişen mıknatıs pozisyonlar (Şekil 2) roll-off frekansı hesabı her ikisini de kullanarak 1 mikron ve 3 mikron boncuk için cımbız kalibre. Kuvveti proteoliz deneylerde, kurulum DNA kolajen (Şekiller 3, 4) ile değiştirilir olması dışında benzer. Kalan boncuk normalleştirilmiş sayı proteoliz oranları (Şekil 5) bulmak için zamanın fonksiyonu olarak çizilebilir ve bu süreç olabilirenzim konsantrasyonu ve güçleri değişen tekrarlandı. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig1.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Manyetik tuzak kalibrasyon işlemini şematik (ölçekli değil). İki kalıcı nadir toprak mıknatıslar süperparamanyetik boncuk çeker bir manyetik alan oluşturur. Yukarı ve aşağı mıknatıs Tercüme uygulanan kuvvet ayarlar. Boncuklar iki mıknatıs arasındaki bir iğne deliğinden geçen ışık ile geleneksel parlak alan mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi işlemidir Ankastre:. Image 40x hava amacı ile çekilen. Keskin, yuvarlak lekeler coverslip yüzeyine yapışan boncuk karşılık gelir. Out-of-focus nesneleri müstakil boncuk vardır. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig2.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. 1 mikron (solda) ve 2.8 mikron (sağda) boncuk için numune yüzeyinden mıknatıs uzaklığın bir fonksiyonu olarak kalibre kuvvet Arsalars. Veri ampirik fonksiyonu için uygun bulundular <img alt="Denklem4" src="/files/ftp_upload/3520/3520eq4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Denklem4"> , Burada x mıknatıs mesafedir. A = 31.8, b = 5.61, ve c 1 mikron boncuk ve için = 4.39 a = 140, b 3 mikron boncuk = 3.10 ve c = 1.86. Bu değerler, belirli bir cihaz ve deneysel bir geometri özgü olan ve her bir cihazın tek tek kalibre edilmesi gerekir. Her noktada hata çubukları boncuk boyutu değişkenliği nedeniyle boncuk bazında bir kordonu üzerine uygulanan kuvvet bir ~% 10 değişkenlik göstermektedir. Uygulanan kuvvet boncuklar hacmi ile orantılıdır ve boncuk hacmi (üretici özelliklerine göre) ortalama üzerinde ~% 9 değişir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig3.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Kuvvetleri proteoliz assay kurulum (Not ölçekli). Kollajen modeli trimer m yoluyla lameller yüzeyine yapışık olduğuSK / anti-myc konjugasyon. Streptavidin kaplı boncukların süperparamanyetik bir biyotin-streptavidin bağı ile kolajen trimerler bağlıdırlar. Aktif MMP-1 kesim zamanla kolajen, boncuklar yüzeyden ayırmak ve odak düzlemi uzaklaşmaya neden olur. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig4.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Zamanın bir fonksiyonu olarak proteoliz şematik çizgi. Karikatür proteoliz zamanla görüş örnek bir alan oluşur gösterir. Zamanla, MMP-1 keser kolajen ve boncuk ayırmak ve manyetik alan etkisi altında odak düzlemi uzaklaşın. <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/3520/3520fig5.jpg" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Proteoliz oranları uygulanan kuvvet 16 bağlıdır. , 6.2 pN (3 uM MMP-1, kırmızı) ve 13 pN (0.2 uM MMP-1; mage; Gösterildi 1.0 pN (siyah 3 uM MMP-1) toplanan verilerNTA). Proteolizin oranları (uyum parametreleri) şunlardır: 0.22 ± 0.02 dk -1 (1 pN), 0.46 ± 0.09 dk -1 (6.2 pN) ve 2.08 ± 0.18 dk -1 (13 pN). Uzun süre puan (&gt; 15 dakika) unproteolyzed boncuk fraksiyonu farklı deneyler arasında ~ 0.25 yaklaşık sabit kalır. Hata çubukları her noktada gözlem sayısı yansıtan Poisson istatistikleri karşılık gelir. N boncuklar için her bir zaman noktasında hata n, 1/2 'dir. Ekli boncuklar fraksiyonunda hata propagation.1 um boncuklar 1,0 pN ve 6,2 pN deneyler ve 2,8 um boncuklar 13 pN deneyler için kullanıldı için kullanıldı hata hesaplandı.

<ol><li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+cancer+be+reversed+by+engineering+the+tumor+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).</li>
<li>Hahn, C., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction+in+vascular+physiology+and+atherogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction in vascular physiology and atherogenesis.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, 53-62 (2009).</li>
<li>Laurens, N., Koolwijk, P., de Maat, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+structure+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Thromb.+Haemost%22%5BJournal%5D)">Fibrin structure and wound healing.</a> J. Thromb. Haemost. 4, 932-939 (2006).</li>
<li>Adhikari, A. S., Chai, J., Dunn, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Load+Induces+a+100-Fold+Increase+in+the+Rate+of+Collagen+Proteolysis+by+MMP-1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Mechanical Load Induces a 100-Fold Increase in the Rate of Collagen Proteolysis by MMP-1.</a> J. Am. Chem. Soc. 133, (2011).</li>
<li>Zareian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+collagen%2Fenzyme+mechanochemistry+in+native+tissue+with+dynamic%2C+enzyme-induced+creep%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Probing collagen/enzyme mechanochemistry in native tissue with dynamic, enzyme-induced creep.</a> Langmuir. 26, (2010).</li>
<li>Ellsmere, J. C., Khanna, R. A., Lee, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+of+bovine+pericardium+accelerates+enzymatic+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading of bovine pericardium accelerates enzymatic degradation.</a> Biomaterials. 20, 1143-1150 (1999).</li>
<li>Jesudason, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+forces+regulate+elastase+activity+and+binding+site+availability+in+lung+elastin%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanical forces regulate elastase activity and binding site availability in lung elastin.</a> Biophys. J. 99, 3076-3083 (2010).</li>
<li>Neuman, K. C., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Optical trapping.</a> Rev. Sci. Instrum. 75, 2787-2809 (2004).</li>
<li>Lee, C. K., Wang, Y. M., Huang, L. S., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy%3A+determination+of+unbinding+force%2C+off+rate+and+energy+barrier+for+protein-ligand+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy: determination of unbinding force, off rate and energy barrier for protein-ligand interaction.</a> Micron. 38, 446-461 (2007).</li>
<li>Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+mechanical+measurements+of+the+elasticity+of+single+DNA+molecules+by+using+magnetic+beads%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads.</a> Science. 258, 1122-1126 (1992).</li>
<li>Tanase, M., Biais, N., Sheetz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers in cell biology.</a> Methods Cell Biol. 83, 473-493 (2007).</li>
<li>Neuman, K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat. Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Frank, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+short+collagen-like+triple+helices+by+protein+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Stabilization of short collagen-like triple helices by protein engineering.</a> J. Mol. Biol. 308, 1081-1089 (2001).</li>
<li>Stetefeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+stabilization+at+atomic+level%3A+crystal+structure+of+designed+%28GlyProPro%2910foldon%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Collagen stabilization at atomic level: crystal structure of designed (GlyProPro)10foldon.</a> Structure. 11, 339-346 (2003).</li>
<li>Chung, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagenase+unwinds+triple-helical+collagen+prior+to+peptide+bond+hydrolysis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Collagenase unwinds triple-helical collagen prior to peptide bond hydrolysis.</a> EMBO J. 23, 3020-3030 (2004).</li>
<li>Bell, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+for+the+specific+adhesion+of+cells+to+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Models for the specific adhesion of cells to cells.</a> Science. 200, 618-627 (1978).</li>
<li>Selvin, P. R., Ha, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSelvin%2C+PR+%22Single-molecule+techniques%3A+a+laboratory+manual%22">Single-molecule techniques: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).</li>
<li>Graneli, A., Yeykal, C. C., Prasad, T. K., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organized+arrays+of+individual+DNA+molecules+tethered+to+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Organized arrays of individual DNA molecules tethered to supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 22, 292-299 (2006).</li>
<li>Danilowicz, C., Greenfield, D., Prentiss, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissociation+of+ligand-receptor+complexes+using+magnetic+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Dissociation of ligand-receptor complexes using magnetic tweezers.</a> Anal. Chem. 77, 3023-3028 (2005).</li>
<li>Zhang, X., Halvorsen, K., Zhang, C. Z., Wong, W. P., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanoenzymatic+cleavage+of+the+ultralarge+vascular+protein+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mechanoenzymatic cleavage of the ultralarge vascular protein von Willebrand factor.</a> Science. 324, 1330-1334 (2009).</li>
<li>Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomechanical+measurements+of+the+sequence-dependent+folding+landscapes+of+single+nucleic+acid+hairpins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Nanomechanical measurements of the sequence-dependent folding landscapes of single nucleic acid hairpins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 6190-6195 (2006).</li>
<li>del Rio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stretching+single+talin+rod+molecules+activates+vinculin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stretching single talin rod molecules activates vinculin binding.</a> Science. 323, 638-641 (2009).</li>
<li>Gosse, C., Croquette, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+tweezers%3A+micromanipulation+and+force+measurement+at+the+molecular+level%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Magnetic tweezers: micromanipulation and force measurement at the molecular level.</a> Biophys. J. 82, 3314-3329 (2002).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu protokol, klasik bir tek bir molekül tekniği için yeni bir kullanımını açıklar. Manyetik cımbız, bir maliyet-etkin şekilde yüksek verimli tek bir molekül testleri orta sağlar. Ancak, tüm deneysel teknikler gibi zorluklar ve potansiyel tuzaklar vardır. Manyetik cımbız Sınırlamalar Optik bir tuzak ile karşılaştırıldığında MT aygıtının mekansal ve zamansal çözünürlüğü düşük. Bundan başka, burada açıklanan basit MT tarafından üretilen kuvvetleri rutin AFM deneylerde ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Mikro Kapak Cam # 1.5 (22x22) </td><td> VWR </td><td> 48366-067 </td></tr><tr><td> Mikro Kapak Cam # 1.5 (22x40) </td><td> VWR </td><td> 48393-048 </td></tr><tr><td> Lambda DNA </td><td> Invitrogen </td><td> 25250-010 </td></tr><tr><td> T4 DNA ligaz </td><td> Invitrogen </td><td> 15224-041 </td></tr><tr><td> Microcon Ultracel YM-100 </td><td> Millipore </td><td> 42413 </td></tr><tr><td> Anti-digoxigenin </td><td> Roche Diagnostics </td><td> 11-333-089-001 </td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Sigma </td><td> P9416-100ML </td></tr&gt; <tr><td> Anti-myc Antikor </td><td> Invitrogen </td><td> 46-0603 </td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> Sigma </td><td> B4287-5G </td></tr><tr><td> Dynabeads M-280 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> Dynabeads MyOne T1 Streptavidin </td><td> Invitrogen </td><td> 658.01D </td></tr><tr><td> p-Aminophenylmercuric asetat </td><td> Calbiochem </td><td> 164610 </td></tr><tr><td> Biotin-maleimid </td><td> Sigma Aldrich </td><td> B1267 </td></tr><tr><td> Biotin oligo etiketli </td><td> IDT DNA </td><td> Özel sentezi </td></tr><tr><td> Digoxigenin oligo etiketli </td><td> IDT DNA </td><td> Özel sentezi </td></tr><tr><td> Kollajenpeptid gen </td><td> DNA 2.0 </td><td> Özel sentezi </td></tr><tr><td> MMP-1 cDNA </td><td> Harvard Plazmid Veritabanı </td><td></td></tr><tr><td> z-çevirmen </td><td> Thorlabs </td><td> MTS50 </td></tr><tr><td> Çevirmen için servo kontrol </td><td> Thorlabs </td><td> TDC001 </td></tr></tbody></table>

manyetik cımbız kullanarak multiplexed tek molekül kuvvetleri proteoliz Ölçümleri

Multiplexed Single-molecule Force Proteolysis Measurements Using Magnetic Tweezers

Mekanik güçlerin üretme ve algılama kanser metastazı 1, aterogenez 2 ve 3 yara iyileşmesi ile doğrudan ilgili olan, hücre fizyolojisi her yerde görülen bir yönüdür. Bu örneklerin her birinde, hücreler çevreleri üzerinde kuvvet uygularlar ve aynı enzimatik remodel ekstraselüler matriks (ECM) hem de. ECM kuvvetlerin etkisi böylece 4-7 büyük olasılıkla onun biyolojik ve tıbbi önemi nedeniyle önemli bir ilgi alanı haline gelmiştir. Gibi optik tuzaklama 8, atomik kuvvet mikroskobu 9, ve manyetik cımbız 10,11 olarak tek bir molekülün teknikleri araştırmacılar bireysel proteinler üzerinde kuvvetleri uygulayarak moleküler düzeyde enzim fonksiyonu soruşturma için izin. Bu tekniklerin, manyetik cımbız (MT) Düşük maliyet ve yüksek verimlilik için dikkat çekicidir. MT ~ 1-100 pN aralığında kuvvetleri uygulamak ve milisaniye zamansal çözünürlük sağlayabilir,ayrıca tek moleküllü seviyesi 12 az enzim mekanizmasının çalışma eşleştirilir nitelikleri. Burada tek bir protein moleküllerinin proteoliz tarihinde yürürlüğe etkisini incelemek için son derece parallelizable MT tahlil raporu. Bu matris metalloproteinaz 1 (MMP-1) tarafından bir trimeric kolajen peptid proteolizin spesifik bir örnek sunmak; Bununla birlikte, bu tahlilde kolayca diğer substratlar ve proteazlar incelemek için adapte edilebilir.

Bu yazıda son derece parallelizable şekilde tek bir molekül düzeyinde enzimatik proteolizin yürürlüğe etkisini incelemek için manyetik cımbız kullanımı açıklanır.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Mekanik kuvvetlerin üretimi ve algılanması, kanser metastazı1, aterojenez2 ... ile doğrudan ilişkili olan ve hücre fizyolojisinin her alanında görülen bir yönüdür.

Bu prosedürün genel amacı, mekanik yükün tekil proteinlerin proteolitik parçalanması üzerindeki etkisini yüksek düzeyde paralel ve maliyet etkin bir şekilde incelemektir. Bu gösterimde, ilk adımda matris metalloproteinaz bir tarafından kolajenin parçalanması incelenmekte, ardından akış hücresinin cam lameline kolajen kırpıcılar tutturulmakta ve ardından tekil kolajen moleküllerine mikrometre boyutunda manyetik boncuklar bağlanmaktadır. İkinci adım, akış hücresinin manyetik cımbız düzeneğine yerleştirilmesi ve spesifik olmayan şekilde bağlanmış boncukların lamel yüzeyinden uzaklaştırıldığının kontrol edilmesidir.Ardından, proteaz akış hücrelerine eklenir. Son adım, boncuk ayrılmasını gerçek zamanlı olarak izleyerek proteoliz hızını belirlemektir. Farklı proteaz konsantrasyonlarında ve kuvvetlerde boncuk ayrılma hızları ölçülerek, çok küçük miktarlarda substrat ve proteaz kullanılarak standart zoolojik kinetik parametrelerin türetilmesi mümkündür.Ayrıca bu teknik, mekanik kuvvetin proteoliz hızı üzerindeki etkisi ve kesilme işlemine eşlik eden substrat proteinindeki yapısal değişiklikler hakkında benzersiz bilgiler sağlar. Bu tekniğin optik T izleri ve atomik kuvvet mikroskobu gibi d

multiplexed-single-molecule-force-proteolysis-measurements-using

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Manyetik cımbız, güçlü bir tek moleküllü manipülasyon teknikleri, biyolojik makromoleküllerin (manyetik bir tork cımbız olarak adlandırılan bir konfigürasyonu kullanılarak) ve tork (manyetik cımbız serbestçe yörüngeli adı konfigürasyonu kullanılarak) bükümün doğrudan ölçümleri için uyarlanabilir. Bu tür ölçümler yapmak için rehber DNA ve ilgili nükleotid protein filamanların çalışma uygulamaları da dahil olmak üzere verilmiştir.

Büküm ve Moment Ölçümü için Manyetik Cımbız

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

TEK molekül düzeyinde DNA'nın bölgeye özgü dekoltesini ölçmek için son derece paralel bir yöntem tanımlanmıştır. Bu protokol, kısıtlama enonuclease NdeI kullanarak tekniği göstermektedir. Yöntem kolayca siteye özgü DNA bölünmesi ile sonuçlanan herhangi bir süreci incelemek için değiştirilebilir.

Siteye Özgü DNA Bölünmesi için Paralel Yüksek İş Kinetik Test

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Burada, kuvvete duyarlı biyomoleküller üzerinde maksimum 1.2 kHz hızında nanomekanik ölçümler yapan yüksek hızlı bir manyetik cımbız kurulumunu açıklıyoruz. DNA saç tokalarına ve SNARE komplekslerine model sistemler olarak uygulanmasını tanıtıyoruz, ancak mekanobiyolojik olaylarda yer alan diğer moleküllere de uygulanabilecektir.

Kuvvete duyarlı elemanlarda nanomekanik ölçümler için yüksek hızlı manyetik cımbız

Bu protokol, telomerik DNA bağlayıcı proteinler (Telomer Tekrar Bağlama Faktörü 1 [TRF1] ve TRF2) ile insan hücrelerinden ekstrakte edilen uzun telomerler arasındaki etkileşimleri incelemek için tek moleküllü manyetik cımbızların kullanılmasını göstermektedir. Telomerler ve telomerik tekrar bağlama faktörleri için hazırlık adımlarını, tek moleküllü deneylerin yürütülmesini ve veri toplama ve analiz yöntemlerini açıklar.

Tek Moleküllü Manyetik Cımbız Kullanarak Telomerik Protein-DNA Etkileşimlerinin İncelenmesi

Daha kısa DNA moleküllerinin mekanik özelliklerini incelemek için sabit bir kuvvet eksensel optik cımbız kullanımını göstermektedir. Eksenel DNA germe, biz bize ~ 100 nm gibi kısa DNA molekülleri çalışmaya izin sterik engel ve konvansiyonel yanal manipülasyon doğan eserler minimize.

Sabit Kuvvet Eksenel Optik cımbız ile DNA Kısa Diziler Stretching

Sebat uzunluğu veya biyopolimerlerin eğilme rijitliği ölçmek için bir yöntem tarif edilmiştir. Yöntem deneysel olarak bireysel mikrotübül kalıcılığı uzunluğunu belirlemek için bir kinesin tahrik mikrotübül kayma deneyi kullanmaktadır ve aktin bazlı kayma deneyleri için uyarlanabilir.

Kayma Tahliller kullanma Biyopolimerler eğilme Katılığı Ölçümleri

Selülozomlar, selülozu sindirmek için tasarlanmış multienzim kompleksleridir. AFM tabanlı SMFS, selülozomla ilişkili protein düzeneklerinin mekanik özelliklerini ve katlanma konfigürasyonunu incelemek için kullanıldı. Selülozom montajında yer alan bireysel reseptör-ligand komplekslerinin etkileşimlerini incelemek için protein immobilizasyonu, veri toplama ve veri analizi için eksiksiz bir iş akışı sunuyoruz.

AFM-tabanlı Tek-molekül Kuvvetleri Spektroskopisi ile cellulosome Reseptör-ligand Sistemleri Araştırılması

Bu protokol, canlı hücrelerin yüzeyindeki tek reseptörleri görselleştirmek ve izlemek ve böylece reseptör yanal hareketliliğini, reseptör komplekslerinin boyutunu analiz etmek ve ayrıca geçici reseptör-reseptör etkileşimlerini görselleştirmek için toplam iç yansıma floresan mikroskobunun nasıl kullanılacağını açıklar. Bu protokol diğer zar proteinlerine genişletilebilir.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Öğrenin manyetik cımbız kullanarak tek molekül proteoliz ölçümlerini. Bu yöntemle mekanik yükün enzimatik aktivite üzerindeki etkisini yüksek verimli ve maliyet etkin şekilde inceleyin.

Manyetik cımbız kullanarak Multiplexed Tek molekül Kuvvetleri Proteoliz Ölçümleri

Daha fazla video keşfet