Tüm larva aşamalarında yüksek çözünürlüklü C. elegans görüntüleme

Laboratuvarda her türlü gelişim biyolojisi sorusu üzerinde çalışıyoruz. Ben kendim daha çok teknik tarafta çalışıyorum, görüntüleme tekniklerini kullanarak bu soruları daha iyi ele almak için yöntemler geliştiriyorum. C. elegans alanı, CRISPR gen düzenleme, transkriptomik ve proteomikten süper çözünürlüklü mikroskopiye kadar çok çeşitli yöntemleri başarıyla benimsemiştir. C. elegans harika bir modeldir, ancak yüksek çözünürlükte in vivo gözlem bağlamında, en iyi çözünürlük için immobilizasyon gerektiren ve bu da hayvan canlılığını sınırlayan zorluklarıyla birlikte gelir. Protokol, uzun süreli C. elegans görüntüleme için olası bir çözüm sunarak, araştırmacıların yöntemi kendi laboratuvarlarında benimsemelerine ve çok çeşitli dinamik gelişimsel süreçleri doğrudan in vivo olarak incelemelerine olanak tanır. Laboratuvar içinde, yöntem, örneğin morfogenez bağlamında veya somatik hücre bölünmelerini yetişkinliğe kadar takip ederek organ oluşumunun ayrıntılı olarak gözlemlenmesine izin vermiştir. Yöntem o zamandan beri çok çeşitli gelişimsel süreçleri inceleyen çok sayıda laboratuvar tarafından benimsenmiştir.

[Sunucu] Başlamak için, cihazı destek çerçevesine takın ve dik mikroskobun üzerine monte edin. Bir şırıngayı deiyonize suyla doldurun, ardından 23 gauge bir iğne ve içi boş bükülmüş çelik bir pim ile 16 inçlik uzun bir boru parçası takın. Boruyu şırıngadan deiyonize su ile doldurun ve boruyu bağlamak için çelik pimi valf girişinin delinmiş deliğine sokun. Hortumu çip dışı solenoide takmadan önce şırıngayı ve iğneyi çıkarın. Görüntüleme yazılımını kullanarak solenoidi açın ve valfteki tüm havayı dışarı atmak için cihaza birkaç dakika basınç uygulayın. Hava su arayüzünün karanlık göründüğünü ve PDMS malzemesinin içinde kaybolduğunu görsel olarak kontrol ederek tamamlandığını doğrulayın. Görüntüleme yazılımını kullanarak solenoidi kapatın. Daha sonra, bir mililitrelik bir şırıngayı filtrelenmiş bakteri çözeltisiyle doldurun ve iğneye 30 gauge bir iğne ve 32 inçlik uzun bir boru parçası takın. Hem iğneyi hem de bağlı boruyu bakteri çözeltisiyle doldurmak için pistona basın. Daha sonra cımbız kullanarak, bir x 32 inçlik boruyu doğrudan mikroakışkan cihazın gıda girişine yerleştirin ve şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin. Cihazı sıvı ile doldurmak için arkadaki kelebek vidayı kullanarak şırınga pistonuna bastırın. Hem sonsuz vida girişini hem de çıkışını sızdırmaz çelik pimlerle bloke edin ve cihazda kalan havayı çıkarmak için ayar vidasını kullanarak ek basınç uygulayın. Ardından çıkıştaki tıkalı çelik pimi çıkarın ve atık kabını prize takın. Atık kabının doğru şekilde bağlandığından ve sistemde herhangi bir tıkanıklık olmadığından emin olmak için şırıngayı itin. İkinci tıkalı çelik pimi girişten çıkarın ve şırıngayı solucan girişinde küçük bir damla sıvı görünene kadar itin. Daha sonra 23 gauge bir iğne kullanarak, S-bazal tampon ile doldurulmuş bir mililitrelik şırıngaya yaklaşık 15 ila 20 santimetre ölçülerinde 16 inçlik bir borudan daha uzun bir parça takın. Borunun diğer ucuna düz bir 23 gauge çelik pim takın. İğneyi ve hortumu şırıngadan S-bazal tampon ile doldurun. Şimdi, borunun ucundaki çelik pimi solucanları içeren tüpe yerleştirin ve hava kalmadığından emin olmak için borudan az miktarda sıvı itin. Solucanları şırıngaya çekmeden borunun içine çekin. Ardından, çelik pim üzerinde küçük bir damla sıvı görünene kadar solucanlara bağlı şırıngayı itin ve çelik pimi mikroakışkan cihazın sonsuz girişine yerleştirin. Cihazı 5x veya 10x gibi düşük büyütmeli bir mikroskoba veya bir diseksiyon mikroskobuna yerleştirin. Cihazı, görüş alanının bir tarafında giriş görünecek ve diğer tarafta tuzak kanalı girişinin arkası görünecek şekilde konumlandırın. Solucan şırıngasının pistonunu yavaşça itin. Ardından, hayvanları kanal dizisine doğru itin. Bir hayvan kanala baktığında, onu kanala itin ve diğer hayvanlar için tekrarlayın. Yeterli sayıda hayvanı yakaladıktan sonra, hala solucan girişine bağlı olan şırıngayı, deney boyunca kalacağı mikroskop aşamasına yerleştirin. Yükleme bir diseksiyon mikroskobunda yapıldıysa, cihazı görüntüleme mikroskobuna aktarın. Şimdi, şırınga pompasını açın ve 0,5 mikrolitre için saatte bir mikrolitre önceden ayarlanmış bir hızda çalıştırın. Şırınga pompasını 0,5 mikrolitre için saatte bir mikrolitre hızında çalışacak şekilde programlayın, ardından akış hızı 0,5 mikrolitre için saatte 100 mikrolitre artırılır ve akış modeli deney boyunca tekrarlanır. Cihazı mikroskop tablasına yerleştirin ve sıkıca tutulduğundan emin olun. İstediğiniz görüntüleme büyütme oranına geçin. Tuzak kanalı dizisi içindeki hayvanları ve ilgilenilen bölgeleri belirleyin ve istenen görüntüleme koşullarını ayarlayın. İstenilen görüntüleme koşullarında görüntü, görüntü alımından 10 saniye önce çip üzerindeki valfi solenoidden geçirerek hayvanların yerinde tutulmasını sağlar. Mikroakışkan cihaz, 170 mikrometre kalınlığında bir kapak camının kullanılması nedeniyle parlak alan, epifloresan, dönen disk konfokal ve süper çözünürlük yöntemleri dahil olmak üzere çeşitli mikroskopi modalitelerinde yüksek görüntüleme kalitesini korudu. Erken L1'den orta L2 larva evresine kadar görüntülenen Caenorhabditis elegans epitel hücrelerinin gelişimi. Primer solmuş vulva öncü hücrelerinin indüksiyonu ve bunların geç L1'den erken L4 larva evresine müteakip bölünmeleri belirgindi. Erken L3'ten erişkinliğe kadar vulva oluşum aşamaları. Elde edilen görüntüler, görüntü evrişiminin bozulması ve kaydedilmesi yoluyla geliştirildi, görsel netlik artırıldı Görülen hücre bölünmeleri, tüm hayvanlarda tutarlı ve zamanında meydana geldi ve tüm bölünmeler tipik larva aşama süreleri içinde tamamlandı. Gonad uzunluğu, L2 ve L3 aşamalarında, hayvanların düz oryantasyonu ile sağlanan tutarlı ölçümlerle istikrarlı bir şekilde artmıştır.