Mezoskopik Tüm Hücreli Beyin Haritalama İçin Taramalı Elektron Mikroskopi Uyumlu Optik Görüntüleme Yöntemi

Araştırmalarımız konnektomiğe odaklanıyor. Bir nöro devrenin ve sinaptik bağlantı özelliklerinin analizini mümkün kılan yüksek verimli optik veya elektron görüntü alma yöntemleri geliştiriyoruz; böylece nöro devrelerin temel bağlantı mantığını çözmek için bir nöro devresi ve sinaptik bağlantı özellikleri analiz ediliyor. Orijinal yüksek devrim konnektomikleri, maliyetli veri toplama ve tam olarak küçük beyin hacimleriyle sınırlıdır; hızlı mikroskobik analiz ve hedefe yönelik mikroskobik çalışmalar ise tüm beyin konnektomiği için potansiyel sunar.

Çeşitli Larsens mikroskopları gibi diğer mikroskobik yaklaşımlara kıyasla, OMLIT tüm nöronların görüntülerini dendrit ve akson endişesi bilgisiyle yakalar. Elektron mikroskopla uyumluluğunun yanı sıra, EF altında daha fazla nano ölçekli çözünürlüklü görüntüleme de mevcuttur. OMLIT, tüm uzun menzilli projeksiyonları, yönlerini, gücü ve tipini yerel mikro devrelerle birlikte seri temalarla birlikte haritalayan kapsamlı beyin modelleri oluşturmaya yardımcı olur. Yapılandırılmış mimariye ve tüm beyin boyunca bilgi akışına dair içgörü sunar.

OMLIT tanımlı RI'lar tarafından yönlendirilen otomatik OMLIT görüntüleme ve EM veri toplama geliştiriyoruz; böylece büyük veya tüm beyin hacimlerinde verimli connectomik veri toplama ve analiz sağlıyoruz. Başlamak için, motorlu sarma sistemine monte edilen 50 mikrometre kalınlığında kapton veya D50 filmi seçin. Çift başlı magnetron sputtering sistemi kullanılarak, alüminyum, gümüş veya bakır gibi krom veya diğer metallerden oluşan uniform ince bir tabaka bant yüzeyine yerleştirin.

Bandı, sıçrayan hedeften 80 milimetre mesafeye konumlandırın. Süreci doğrudan akım gücüyle ve %99,99 argon gazıyla düzenlenen bir paskal basınçta gerçekleştirin. Şimdi, bant sarma hızını saniyede 0,6 milimetreye ayarlayarak 50 nanometre metal kaplama kalınlığına ulaşın.

Biriktirmeden sonra, sistem oda sıcaklığına soğuduktan sonra bantı çıkarın. Kaplamanın kalınlığını ve düzenliliğini bir stylus profilleyici, atomik kuvvet mikroskobu veya taramalı elektron mikroskopisi kullanarak değerlendirin. Düşük yansıtıcılık stratejisi için, bandı 80 watt gücünde plazma temizleyici kullanarak temizleyin ve hidrofilik hale getirin, bandı saniyede yedi milimetre hızla hareket ettirin.

İşlemden sonra, su damlacıklarını bant yüzeyine yerleştirerek ince bir filme hızla yayıldıklarını doğrulayın. Küçük bir öğütücü veya benzeri bir kesme aleti kullanarak, örnek tarafındaki reçineyi kaba kesimleyerek çevresindeki boş reçineyi çıkarın ve örnek alanını açığa çıkarın. Reçine gömülü bloğu örnek tutucuya yerleştirin ve bloğu sıkıca sabitlemek için sıkın.

Örnek tutucuyu mikrotomun hareketli koluna monte edin. Bıçak tutucuya 45 derece açıyla cam bıçak veya elmas kesme bıçağı takın. Mikroskop altında, örnek yüzeyini piramit şeklinde kesip düzleştirin, ardından numune bloğunun dört tarafını kırpıp düzleştirerek fazla reçineyi giderin.

Düğmeyi döndürerek blokun ön ve arka kenarlarını yatay konumda hizalasın. Kesme bıçağını çıkarın ve yerine 45 derece açıyla yerleştirilmiş elmas bıçak kullanın. Mikrotom tabanının eğim açısını altı dereceye ayarlayın ve bıçak tutucusunu düğmeyle yavaşça hareket ettirin, bıçağın ön kenarı numune yüzeyinden bir ila iki milimetre uzakta olsun.

Örnek yüzeyi ile bıçak kenarı arasındaki parlak bandı gözlemleyin ve eğim açısını ayarlayın, bandın yukarıdan aşağıya ve yandan yana eşit olmasını sağlar. Şimdi, elmas bıçağın yuvasına damıtılmış su enjekte ederek bıçağı ıslatın. Sıvı seviyesi düşene kadar şırıngayla biraz su çıkarın ve yansıma gümüş gibi görünsün.

Sonra, kontrol ünitesinde kesim kalınlığı kesme hızını ve kesme penceresini ayarlayın. Parçalama hızını saniyede 0,6 milimetreye ve kesit kalınlığını örnek kalitesine bağlı olarak 60 nanometreye ayarlayın. Mikrotomla kesitlere başlayın.

Stabil ve tekiz kesitler üretildikten sonra süreci durdurun. Sonra ince bir fırça kullanarak kesilmiş kesimleri ve kalıntıları temizleyin. Şimdi hem kaplamalı bant makarını hem de boş bir tutma makarını otomatik, ultra ince kesit toplama sistemine takın.

Kilitleme mekanizmasını sabitleyin ve sabit hızda düzgün hareket ile toplama makarasına doğru toplanmasını doğrulamak için deneme işlemi yapın. Bantlanmış toplama cihazının toplama başını elmas bıçağın su banyosuna daldırın ve başı, örnek dilimi uzunluğunun 1,5 katı olan bıçağın kenarına paralel olacak şekilde ayarlayın. Toplama cihazını güvence altına alın ve bölümlere devam edin, aynı anda bant toplama cihazını çalıştırın.

Yeterli kesitler toplandıktan sonra kesitleri durdurun. Bandı kesitsiz bir alanda kesin. Bant toplama cihazını tüm bantlar makara sarana kadar çalıştırın.

Sonrasında makarayı çıkarın ve elektronik kurutma fırınına yerleştirin. Bant toplama cihazını ve mikrotomu temizleyin ve tüm aksesuarları doğru yerlerine geri koyun. Silikon levhaya monte etmek için, çift taraflı iletken banttan şeffaf koruyucu filmi soyun.

Bandı çift taraflı iletken banda paralel olarak uygulayın, her parçaya en fazla üç parça bant yerleştirin. Silikon levhayı optik mikroskopun sahnesine yerleştirin ve kalıntısız yapışkan bantla sabitleyin. Silikon wafer, bant ve örnek hakkında genel bir görüntü elde etmek için beş X objektif lens kullanın.

Genel görüntüde her bölümü çizip sıralayın, ardından odak ve pozlama noktaları ekleyerek tüm wafer boyunca 20 veya 50 X büyütme ile otomatik görüntüleme yapılabilir. Görüntülemeden sonra görüntüleri kaydedin ve kalitelerini kontrol edin, odaklama ve kalite düşük ya da odak dışı varsa yeniden görüntüleyin. TIFF görüntü yığınını VAST 22'ye import et, ardından görüntülerden VSV dosyasına görüntü hacmi aktar.

Harici bir tablet takın ve fırça aracı ile çizim modunu kullanarak yapıları manuel olarak segment ve izler yapın. Görüntü dilimleri arasında gezinmek için A ve Z kısayol tuşlarını kullanın. Şimdi, segmentli yapıyı üç boyutta görselleştirin; pencere, ardından 3D görüntüleyici, görüntü ve güncelleme seçeneklerini seçin.

Son olarak, dosyayı seçtikten sonra segmentasyon sonuçlarını kaydedin ve segmentasyonu kaydedin. Yüksek yansıtıcılıklı görüntülerde, sitoplazmik ve damar lümenleri çevredeki alanlara göre daha yüksek yoğunluk gösterirken, düşük yansıtıcılıklı görüntülerde sitoplazmik ve damar lümenleri daha düşük yoğunluk gösterdi. Nicel sonuçlar, yüksek yansıtıcılık ve düşük yansıtıcılık stratejilerinin olduğunu gösterdi.

Her birinin kontrast ve bilgi entropisi açısından avantajları vardı. OMLIT optik mikroskopi görüntüleme, aksonların, kan damarlarının, hücre gövdelerinin ve dendritlerin tanımlanmasına olanak sağladı. VAST kullanılarak omlet görüntülerinin manuel segmentasyonu, çok sayıda sıkı düzenlenmiş hücre gövdesi, dendrit ve akson gösterdi.

Segmentli sonuçlar, orijinal görüntüyle birleştirilerek üç boyutlu bir görselleştirme oluşturuldu. Büyütülmüş OMLIT görüntüleri, daha ince yapıları ortaya çıkarmak için yeterli çözünürlük göstermedi. Aynı bölgenin elektron mikroskopisi görüntüleri sinapslar, mitokondriler, hücre çekirdekleri ve vezikülleri ortaya çıkardı.