Hastalık Tanısı ve Tedavilerde Bireysel SEV'lerin Yüzeye Güçlendirilmiş Raman Saçılmasına Dayalı Biyosensörleme'nin Uygulanmasını Araştırmak
March 13th, 2026
Burada, etiketsiz yüzey takviyeli Raman spektroskopisi (SERS) kullanılarak bireysel küçük ekstrasellüler veziküllerini (sEV) analiz etmek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol, minimal invaziv hastalık teşhisi ve sEV'lerin terapötik teslimat araçları olarak değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.
Kanser erken teşhisiyle ilgilenmek ve ayrıca biyomedikal uygulamalar sunmak için yüzeysel güçlendirilmiş Raman saçılmasını makine öğrenimi ile birleştiriyoruz. Önemli deneysel zorluklardan biri, ekzozom örneklerindeki doğada bulunan heterojenliktir; bu da son derece karmaşık, yüksek boyutlu spektroskopik verilerdir; bu da düşük sinyal-gürültü oranıyla daha da karmaşıklaşır. Başlamak için, yaklaşık beş mikrolitre küçük ekstrasellüler vezikül örneğini belirlenen plazmonik substrata pipetleyin.
Substratı bir kurutucuya yerleştirerek damlanın yaklaşık 15 dakika boyunca tamamen kurumasını sağlar. Daha sonra kurutulmuş substratı konfokal Raman mikroskobuna aktarın. Enstrüman yazılımı WiRE sürüm 4.4 kullanılarak veri toplama başlatılır.
Uyarılma lazerini 785 nanometreye beş miliwatt olarak ayarlayın ve sistemi kalibre edin. Altın alt tabakadan spektrum elde etmek için, 300x300 mikrometre alanda bir keşif taraması yaparak tek vezikülleri statik modda 10 mikrometre adım boyutu, 0,1 saniyelik poz ve %50 lazer gücüyle tespit edin. Veziküller bulunduktan sonra, bir mikrometre adım boyutu, her nokta başına 0,2 saniye pozlama ve %50 lazer gücü ile beşe beş ızgarada statik modda yüksek çözünürlüklü haritalama yapın.
Sonrasında, grafen substratından spektrumları aşağıdaki taramaları yaparak alın. İlk ham spektrumları tarayın ve aşırı gürültü veya anormal spektral şekiller gösterenleri dışlayın. Her spektruma bir Savitsk-Golay filtresi uygulayarak floresans arka planını azaltın ve spektral verileri düzleştirin.
Her spektrum için sinyal-gürültü oranını ya tepeden baz çizgiye yöntemi ya da standart sapma yöntemi kullanarak hesaplayın. Her spektrum için, sinyal-gürültü oranını, temsil bir Raman bandında taban çıkarma sonrası zirve yoğunluğun gürültünün standart sapmasına oranı olarak hesaplayın. Gürültüyü, orijinal spektrumdan 11 pencere boyutu ve üç polinom düzeni kullanarak Savitsky-Golay düzleştirilmiş bir spektrum versiyonunu çıkararak tahmin edin.
Tüm spektrumları sinyal-gürültü oranının artan sırasına göre sıralayın ve eşik belirlemek için sıralanmış spektrumlar boyunca tanısal zirvelerin kalıcılığını değerlendirin. Sonra, bu zirvelerden herhangi birinin temel gürültüye dönüştüğü noktaya eşik belirin, bu da sinyal-gürültü oranı 28'e karşılık gelir. Sinyal-gürültü oranı eşiği 28'in altına düşen spektrumlar hariç tutularak sadece yüksek kaliteli spektrumların aşağı akış analizi için tutulmasını sağlar.
Ve kalan her spektrumu ya maksimum zirve yoğunluğuna ya da eğrinin altındaki toplam alana normalleştirin. Her spektral ölçüme kökenine göre bir etiket atayın; örneğin bir mide kanseri hastası veya sağlıklı bir kontrol gibi. Etiketlenmiş spektral verileri, doğrusal çekirdekli bir destek vektör sınıflayıcısına girin ve her katlamada dengeli temsil sağlamak için beş kat çapraz doğrulama için katmanlı bir karıştırma bölmesi uygulayın.
Şimdi, tüm katlar boyunca doğruluk metriklerini ortalamanız için genel model performansını değerlendirin. Son olarak, yüzey destekli Raman saçılma veri setinin boyutsallığını azaltmak için doğrusal ayırt edici analiz (LDA) kullanın. Örnek grupları arasında doğrudan sınıflandırma yapmak için eğitilmiş doğrusal ayırt edici analiz modelini kullanın.
Raman spektrumları ve ilgili ortalama spektrumlar, doku, kan ve tükürük örneklerinden izole edilmiş tek küçük hücredışı veziküllerden elde edilen her örnek tipinde belirgin moleküler imzalar ortaya koydu. Doğrusal ayrımcı analiz, ekstraselüler vezikül verilerinin kaynak dokusuna, kanına veya tükürüğüne göre net kümelenmelerini ortaya koydu. Destek vektör makine sınıflandırıcısı kullanılarak ikili sınıflandırma, doku örnekleri için %90,1 ile en yüksek doğruluğu sağlar; ardından kan %70,9 ve tükürük %60,7 ile gelir. LDA tabanlı sınıflandırma bölünmeleri, doku kaynaklı ekstrasellüler vezikül verilerinde sağlıklı ve mide kanseri örneklerini net şekilde ayırır.
Kan ve tükürükten alınan hücredışı vezikül verileri için benzer LDA tabanlı sınıflandırma bölünmeleri, sağlıklı ve kanser örnekleri arasında daha az optimal ayrım olduğunu gösterdi. Grafen olmadan doksorubisin kuluçka veziküllerinin Raman spektrumları yaklaşık 1.081, 1.206 ve 1.440 ters santimetrede tutarlı zirveler göstermiştir. Grafen ile birlikte, yaklaşık 1.350 ters santimetrede ek bir D tepesi ve yaklaşık 1.580 ters santimetrede bir G zirvesi gözlemlendi ve bunlar iç standartlar olarak hizmet verdi.
442 ters santimetredeki doksorubisin zirvesinin grafen G zirvesine oranı, daha yüksek ilaç konsantrasyonları ve uzun kuluçka süreleriyle arttı. Erken teşhis potansiyeli gösteren hastalık kaynaklarını ayırt etmek amacıyla tek bir vezikül biyokimyasal parmak izi kurduk. Tekniğimizin üç temel avantajı.
Birincisi, çok hassas. İkincisi, invaziv değil. üçüncüsü, parçacıkların lizlenmesini veya fiziksel olarak parçalanmasını gerektirmez.
Gelecekte, spektral profili proteomik profille ilişkilendireceğiz; bu da ekzom içeriğini hücre iletişimi ve taşıma gibi belirli fonksiyonlarla ilişkilendirmeye yardımcı olacaktır.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This protocol presents a label-free analytical platform that integrates surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) with machine learning to detect and molecularly profile individual small extracellular vesicles (sEVs). The method enables high-specificity detection and classification of disease states, such as distinguishing gastric cancer from healthy controls, and quantifies drug loading in single vesicles, supporting both diagnostic and therapeutic applications.
Key Study Components
Area of Science
- Analytical chemistry
- Biomedical diagnostics
- Nanotechnology
- Machine learning applications in biosensing
Background
- Small extracellular vesicles (sEVs) are promising biomarkers for disease diagnosis and therapeutic monitoring.
- Traditional detection methods often require labeling or lysis, which can limit sensitivity and throughput.
- SERS provides molecular fingerprinting capabilities with high sensitivity.
- Machine learning enhances the analysis of complex, high-dimensional spectral data.
Purpose of Study
- To develop a label-free, high-throughput platform for single-vesicle analysis using SERS and machine learning.
- To distinguish between healthy and disease states (e.g., gastric cancer) using sEVs from various biofluids.
- To quantify drug (doxorubicin) loading in individual sEVs for therapeutic assessment.
Methods Used
- Isolation of sEVs via size exclusion chromatography or ultracentrifugation.
- Deposition of sEVs onto engineered plasmonic gold nanopyramid 2D array substrates.
- SERS data acquisition using a confocal Raman microscope with specific laser settings and mapping protocols.
- Preprocessing of spectra (noise filtering, normalization, signal-to-noise thresholding).
- Machine learning analysis using support vector classifiers (SVC) and linear discriminant analysis (LDA) for classification and visualization.
- Use of graphene-coated substrates as internal standards for drug quantification.
Main Results
- Distinct molecular signatures were observed for sEVs from tissue, blood, and saliva.
- Classification accuracies for distinguishing gastric cancer from healthy controls were 90.1% (tissue), 70.9% (blood), and 60.7% (saliva).
- LDA revealed clear clustering of sEVs by source and disease state, especially for tissue-derived samples.
- Quantification of doxorubicin loading in single sEVs was achieved, with graphene peaks serving as internal standards.
Conclusions
- The platform enables sensitive, non-invasive, and label-free detection of sEVs at the single-vesicle level.
- It allows for high-throughput analysis and captures population heterogeneity, aiding early disease detection.
- The method supports both diagnostic and therapeutic applications, including drug loading assessment.
