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Overview

출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
시연 저자: 브래들리 슈미츠

곰팡이는 이종성 진핵 생물이며 효모를 제외하고는 호기성입니다. 그들은 표면 토양에 풍부하고 영양 순환과 유기 물질과 유기 오염 물질의 분해에 자신의 역할에 중요하다. 백색부패균류(phanerochaete chryosporium)예를 들어,(도 1)방향족을 저하시키는 것으로 알려져 있다.

Figure 1
그림 1. 자작 나무에 흰색 부패.

Principles

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토양은 일반적으로 그램 당 곰팡이의 수백만을 포함, 그래서 토양은 일반적으로 희석 계열을 사용하여 희석된다. 희석 계열은 탈화 된 물과 같은 분산 용액에서 주어진 양의 토양을 일시 중단하여 만들어집니다. 현탁액의 알리쿼트는 개별 이산 곰팡이 식민지가 천판에서 자랄 수 있도록 충분히 희석될 때까지 신선한 용액으로 옮겨진다. (그림2)

여러 복제 한천 판에 접종 후, 플레이트는 25 °C에서 배양된다. 거시적 곰팡이 식민지가 형성된 후 그림 3에도시된 대로 계산됩니다. 가정은 하나의 곰팡이 식민지가 하나의 유기체에서 파생되어 있기 때문에, 용어 콜로니 형성 단위 (CfU)는 최종 분석에 사용되며, 결과는 오븐 건조 토양의 그램 당 CFU의 관점에서 표현된다.

비옥한 토양에서 정상적인 컬처 균골 수는 건조 토양의 그램 당 106-106 곰팡이 "프로파굴레스"(포자, 최면 또는 최면 조각)의 범위에 있습니다. 컬처 플레이트 수는 19세기부터 유기체를 열거하는 데 사용되어 왔습니다. 그들은 오늘 계속 사용, 그들은 수행 하는 저렴 한, 작은 노동을 필요로, 빠른, 그리고 상당히 재현. 그러나 결과를 평가할 때 고려해야 하는 여러 오류로 인해 어려움을 겪습니다. 이러한 오류의 가장 중요한 것은 많은 유기체가 미디어 플레이트에서 문화하지 않을 것이라는 사실입니다.

Figure 2
그림 2. 희석 및 도금 기술. 여기서, 희석된 토양 현탁액은 확산 도금의 경우와 같이 표면이 가해지는 것이 아니라 한천 매체에 직접 통합된다. 환경 및 오염 과학에서, 2nd 에드., 학술 언론, 샌디에고, 캘리포니아

Figure 3
그림 3. 로즈 벵골 아가르가 들어 있는 페트리 접시에서 자란 표면 토양에서 분리된 토양 곰팡이. 사진 제공: K.L. 조셉슨 환경 및 오염 과학에서, 2nd 에드., 학술 언론, 샌디에고, 캘리포니아.

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Procedure

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1. 토양 샘플 준비

  1. 먼저, 공지된 양의 축축한 토양을 밤새 건조하고 건조된 토양의 재량에 의해 토양의 초기 수분 함량을 결정한다. 토양의 초기 수분 함량을 결정하는 방정식은 다음과 입니다.
    Equation 1
    (방정식 1)
    어디:
    MC = 수분 함량
    W = 순 중량
    D = 건성 중량
  2. 토양 수분 함량을 건조 중량 기준으로 10%로 늘리기 위해 토양 25g에 첨가해야 하는 물의 양을 계산합니다.
  3. 다음으로, 토양의 25 g에 그 양의 물을 추가합니다.
  4. 플라스틱 랩으로 용기를 덮고 배양 중에 식기를 허용하기 위해 프로브로 필름을 여러 번 펑크합니다. 고무 밴드로 필름을 고정합니다.
  5. 토양을 계량하고 랩을 한 다음 실온에서 샘플을 1 주일 동안 배양합니다.

2. 곰팡이 접종 과 배양

  1. 인큐베이션이 완료되면 토양 샘플을 랩과 고무 밴드로 계량합니다. 수분 손실로 인한 체중 감소를 계산합니다.
  2. 새로운 토양 수분 함량을 계산합니다.
  3. 다음으로 도 2에도시된 토양의 1/10 희석 시리즈를 준비한다. 이로 인해 mL 서스펜션당10-1(병 A),10-2(튜브 B),10-3(튜브 C),10-4(튜브 D),10-5(튜브 E) g 토양의 희석이 발생합니다.
  4. 멸균 로즈 벵골 -연쇄 상미신 한천 접시를 준비합니다. 로즈 벵골과 연쇄상 구균 모두 세균 성장을 억제합니다. 토양 미생물 인구가 높은 매우 비옥한 토양의 경우, 선택한 희석제는 플레이트 당10-3,10-4및 10-5,g 토양과 같은더 높아야합니다.
  5. 각각10-3 플레이트에 희석 튜브10-2에서0.1 mL을 추가하고 에탄올 화염 살균 유리 스프레더를 사용하여 한천 표면에 확산시다. 0.1mL의 수량이 도금되어 있기 때문에, 이것은 효과적인 희석 10-3을만든다. 모든 희석에 대해 다음 단계를 반복합니다.
  6. 1 주일 동안 실온에서 접시를 배양하십시오.

3. 현미경 검사에 의한 식민지 계산 및 검사

  1. 식민지는 각 토양의 하나만 희석으로 계산합니다. 계산된 플레이트에는 신중하게 계산할 수 있는 식민지가 있어야 합니다. 자란 플레이트는 계산해서는 안 됩니다. 마찬가지로, 10개 미만의 식민지가 있는 판을 계산해서는 안 됩니다. 세 가지 식민지의 문화적 특성을 참고하고 설명합니다.
  2. 다음 절차를 사용하여 상세한 현미경 연구를 위해 슬라이드에 압력 테이프(투명 테이프) 마운트를 준비합니다.
    1. 깨끗한 유리 슬라이드의 중앙에 락토페놀 장착 유체 한 방울을 보관하십시오.
    2. 스톡 롤에서 약 3cm 길이의 투명한 셀로판 테이프 스트립을 잘라냅니다. 접착제 표면을 오염하지 않으려면 테이프를 처리할 때 집게를 사용하십시오. 해부 바늘은 집게에서 테이프를 확보하는 데 도움이됩니다.
    3. 테이프의 접착제 면은 포자 곰팡이 식민지의 표면에 적용됩니다. 테이프에 과도한 압력을 피하기 위해주의하거나 너무 조밀 한 덩어리의 최면과 포자가 수집됩니다.
    4. 곰팡이 식민지와의 접촉에서 테이프를 제거하고 유리 슬라이드에 장착 유체의 드롭에 아래로 접착제 측면을 적용합니다. 부드럽고 평평한 악기로 테이프를 부드럽게 문질러 기포를 표현합니다.
    5. 오일침침 목표 아래 테이프 마운트를 현미경으로 검사합니다.
    6. 공급된 곰팡이 식별키(도 4)를사용하여 두 가지 상이한 곰팡이 제네라를 식별합니다.

Figure 4
그림 4. 곰팡이 식별 키.

필라멘트 균류는 다세포, 진핵 생물은 종종 생태계에서 중요한 역할을, 토양에서 많은 수에서 발견. 곰팡이는 실험실에서 격리, 정량화 및 검사 할 수 있습니다.

곰팡이는 표면 토양에 풍부하며 영양 순환 및 유기 물질 및 오염 물질의 분해에 중요한 역할을 수행합니다. 그들의 자신의 음식을 합성 할 수 없는 되 고 그들은 이종성으로 분류 되 고 에어로빅 따라서 산소를 필요로.

곰팡이를 배양하기 위해 토양 샘플은 알려진 농도에서 멸균 물로 희석한 다음 한천 판에 도금되어 배양됩니다. 결과 곰팡이 식민지는 다음 계산 및 식별 될 수있다.

이 비디오는 필라멘트 곰팡이의 고립, 정량화 및 식별의 원리를 보여줍니다.

토양은 일반적으로 그램 당 곰팡이의 수백만을 포함; 따라서, 직렬 희석은 일반적으로 분석을 위해 토양 샘플을 준비하는 데 사용됩니다. 주어진 양의 토양이 분산 용액에 추가됩니다. 현탁액의 알리쿼트는 현탁액이 이산 곰팡이 식민지가 자랄 수 있을 만큼 충분히 희석될 때까지 완충액으로 연속적으로 전달된다.

이러한 희석은 다음 한천 미디어에 도금 및 배양. 일단 눈에 보이는 곰팡이 식민지를 형성하면 계산할 수 있습니다. 각 곰팡이 식민지가 단일 유기체로부터 파생된 것으로 가정되기 때문에, 콜로니 성형 유닛 또는 CFU라는 용어는 마른 토양의 그램당 계산된 유기체의 수를 표현하는 데 사용된다.

대부분의 곰팡이는 식물 성장의 주요 모드인 길고 분기 구조인 최해로 자랍니다. 최해의 집합은 균사체로 불립니다. 곰팡이는 또한 효모가 잘 알려진 예인 단일 세포 유기체로 존재할 수 있습니다.

곰팡이 생식은 여러 가지 방법 중 하나에서 발생할 수 있습니다. 최해 생성 곰팡이는 성균을 단편화하거나 종자 같은 포자가있는 줄기에서 무성도를 재현 할 수 있습니다. 단세포 균류는 신진에 의해 무성한 재생될 수 있습니다.

곰팡이는 성적으로 재현 할 수 있습니다. 이것은 무성 생식보다 덜 일반적이며, 일반적으로 불리한 환경 조건에 응하여 생깁니다. 최해 생성 균류에서는, 다른 곰팡이 균주에서 2개의 생식 최해가 융합되어 zygote를 생성할 수 있습니다. 단세포 균류에서는, 반대 균주의 2개의 세포가 융합될 것입니다.

비옥한 토양은 일반적으로 건조 중량의 그램 당 106 곰팡이 "propagules"의 범위에 포함되어 있습니다. 프로파굴은 곰팡이 포자, 최면 또는 최면 조각입니다. 컬처 플레이트 카운트를 사용하는 것은 곰팡이 함량을 해명하기 위해 빠르고 저렴하며 재현 가능한 기술입니다. 그러나 모든 유기체가 미디어 플레이트에서 배양하는 것은 아니라는 사실에 의해 결과가 왜곡될 수 있습니다.

연쇄상 구균과 같은 항생제를 가진 장미 벵골 천 판은 전형적으로 곰팡이 문화에 사용됩니다. 박테리아는 대부분의 토양에서 곰팡이보다 훨씬 더 많기 때문에 이상적인 곰팡이 미디어는 곰팡이가 살아남을 수 있도록하면서 세균 성장에 대해 선택합니다. 로즈 벵골 염료는 대부분의 박테리아의 성장을 억제하고 곰팡이 식민지의 크기를 줄입니다. 이것은 이상적이며 곰팡이 판의 자라나는 것을 방지하고 박테리아를 제어합니다.

이제 우리는 필라멘트 곰팡이를 배양하는 원리에 익숙해졌으니, 실험실에서 어떻게 이런 일이 수행되는지 살펴보겠습니다.

토양 샘플을 채취하면 분석을 위해 실험실로 가져 오십시오. 먼저 토양의 수분 함량을 계산합니다. 수분 함량을 15%로 끌어들이기 위해 탈이온화된 물을 추가합니다.

플라스틱 랩으로 용기를 덮고 고무 대역으로 고정하여 증발을 제한합니다. 이화를 허용하기 위해 필름을 여러 번 펑크.

토양 샘플 과 용기의 무게와 기록. 자연적으로 발생하는 곰팡이의 성장을 허용하기 위해 1 주일 동안 실온에서 배양하십시오.

토양 샘플과 용기의 무게를 재측정하고 무게를 기록합니다. 일주일 동안 수분 감소로 인한 체중 감소를 계산합니다. 토양에 물을 추가하여 무게를 원래 값으로 되돌려 보세요.

95mL의 증류수에 습한 토양 10g을 넣고 철저히 섞습니다. 이것은 토양의 10g이 약 5mL의 부피를 가지고 있기 때문에10-1 희석이다. 이 스톡 솔루션의 물을 사용하여 1mL의 4개의 직렬 희석을 9mL 블랭크로 수행합니다.

다음으로, 멸균 된 로즈 벵골 - 연쇄상 구균 천 접시 를 수집합니다. 플레이트 2개에 희석튜브10-2로부터0.1mL를 넣고 에탄올-화염 살균 유리 스프레더를 사용하여 한천 표면에 퍼진다. 0.1mL의 수량이 도금되어 있기 때문에, 이것은 효과적인 희석 10-3을만든다.

이 플레이트를 실온의 어두운 캐비닛에 1주일 동안 배양합니다.

1 주일 후, 각 접시에 개별 식민지를 계산합니다. 10~20개의 곰팡이 식민지가 있는 플레이트는 계산되어야 합니다. 플레이트 나 식민지의 특징을 구별하고 설명합니다.

깨끗한 유리 현미경 슬라이드를 가지고 중앙에 락토페놀 장착 유체의 한 방울을 입금. 오염을 방지하기 위해 집게를 사용하여 약 3cm 길이의 투명한 셀로판 테이프 스트립을 잘라냅니다. 필요한 경우 해부 바늘을 사용하여 테이프를 집게에서 제거하십시오.

테이프의 접착제 면을 포지화 곰팡이 식민지 의 표면에 적용하여 과도한 압력을 피하기 위해주의를 기울입니다. 다음으로, 테이프의 접착제 면을 스포어 샘플과 함께 유리 슬라이드의 장착 유체에 적용합니다. 부드럽고 평평한 악기로 테이프를 부드럽게 문질러 기포를 제거합니다.

고성능 목표하에서 테이프 마운트를 검사합니다.

곰팡이는 과일 몸과 포자의 검사에 의해 현미경으로 식별 될 수있다. 곰팡이 식별 키는이 과정을 도울 수 있습니다. 관찰된 일반적인 곰팡이 모형은 페니실륨과 아스퍼길러스를 포함합니다.

플레이트를 사용하여 곰팡이는 세균 열거와 동일한 기술을 사용하여 열거될 수 있습니다.

곰팡이를 식별하고 배양하는 것은 다양한 과학적 응용 분야에 유용합니다.

펄프 및 종이 생산 시설과 같은 산업은 생물학적 펄핑으로 알려진 기술로 펄프 과정에서 나무를 분해하기 위해 필라멘트 균류를 사용할 수 있습니다. 백색 부패와 같은 곰팡이는 목재 칩을 효율적으로 저하시킬 수 있으며 화학 적 또는 기계적 펄프의 사용에 대한 필요성이 감소합니다.

곰팡이는 또한 생분해성 플라스틱의 특정 유형을 포함하여 다른 물질을 분해하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 생분해성 뿌리 덮개 필름이 원치 않는 식물 성장에 일시적인 장벽을 만드는 데 사용될 수있는 농업 또는 원예 응용 프로그램에 유용 할 수 있습니다.

곰팡이는 또한 항생제의 생산자, 20 세기에 의학혁명과 오늘날 감염에 최전선 방어계속 화합물. 페니실린, 널리 사용되는 항생제, 일반적인 필라멘트 곰팡이 페니실륨 루벤에서분리되었다. 오늘날까지 필라멘트 균류는 여전히 고립되어 새로운 항생제를 찾기 위해 연구됩니다.

당신은 방금 필라멘트 곰팡이에 대한 JoVE의 소개를 보았습니다. 이제 토양에서 필라멘트 균류를 배양하는 방법, 정량화하는 방법, 토양에서 흔하게 발견되는 곰팡이 유형을 식별하는 방법을 이해해야 합니다. 시청해 주셔서 감사합니다!

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Results

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콜로니 카운트

토양의 그램 당 곰팡이 식민지의 수는 도금 희석의 상호곱을 곱플레이트에 계산된 식민지의 수와 동일합니다. 예를 들어, 46개의 식민지가10-5의희석으로 계산되는 경우, 토양 의 그램당 CFU는 46 x 105 또는 4.6 x 106입니다.

세 가지 다른 곰팡이 제네라의 식별

곰팡이는 과일 몸과 포자의 검사에 의해 현미경으로 식별 될 수있다. 곰팡이 식별 키는이 과정을 도울 수 있습니다. (그림4) 관찰된 일반적인 곰팡이 모형은 페니실륨과 아스퍼길러스를 포함합니다.

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Applications and Summary

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토양 균류의 희석 및 도금은 토양의 건강을 나타내는 지표로 사용될 수 있습니다. 일반적으로 "건강한"비옥한 토양은 토양 그램당 105 ~ 106 곰팡이가 있습니다. 또한 특정 곰팡이의 순수한 배양을 분리하여 유기 화합물을 저하시키는 능력과 같은 특정 특성에 대해 평가할 수 있습니다. 이들은 백색 부패 균류의 경우와 같이 해로울 수 있습니다, 또는 독성 유기물생분해를 통해 저하 될 때 도움이. 곰팡이의 순수한 문화의 다른 용도는 항생제에 대한 곰팡이의 격리를 포함한다. 예를 들어, 최초의 항생제는 토양 매개 곰팡이 페니실린에의해 생성된 페니실린이었다. 이것은 1929년에 알렉산더 플레밍 경에 의해 처음 발견되었습니다.

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References

  1. Pepper, I.L., Gerba, C.P., Brusseau, M. Environmental & Pollution Science, 2nd Ed. Academic Press, San Diego, CA. (2006).
  2. Pepper, I.L., Gerba, C.P. Environmental Microbiology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Academic Press, Boston, MA. (2005).

Transcript

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