Estrazione tramite sonicazione di biomarcatori lipidici dal sedimento

Il primo passo in paleoclimatologia è quello di raccogliere, o estrarre, i biomarcatori dal sedimento in cui si trovano. I campioni ambientali sono composti da componenti non organici, come minerali, acqua e metalli, e componenti organici creati da organismi viventi nell'area. Prima che questi componenti organici possano essere utilizzati dagli scienziati per chiarire le informazioni sul passato, devono essere rimossi dal loro ambiente. La sonicazione, che utilizza onde ultrasoniche, è la più semplice e meno costosa di queste tecniche.

Questo video fa parte di una serie sull'estrazione, la purificazione e l'analisi dei lipidi dai sedimenti. Illustrerà l'estrazione lipidica mediante ultrasuoni e presenterà alcune applicazioni del metodo.

A causa dell'ampia gamma di biomarcatori, non esiste un singolo solvente ottimizzato per estrarli tutti. Questo è riassunto dalla cosiddetta regola "come dissolve come", per cui molecole relativamente apolari si dissolvono in solventi apolari come il diclorometano e più molecole polari si dissolvono in solventi più polari come il metanolo. Le miscele di solventi per l'estrazione di lipidi specifici o gruppi di lipidi sono generalmente ottimizzate empiricamente.

Per accelerare l'estrazione e aumentare la resa, viene utilizzato un sistema di sonicazione per applicare ultrasuoni - onde con frequenze superiori a 20 kHz, in combinazione con la miscela di solvente. Quando queste onde entrano in contatto con la fase organica liquida, causano la formazione di microbolle di breve durata di vapori di solvente che crescono e collassano rapidamente. Al collasso, queste bolle rilasciano un'enorme quantità di energia come taglio meccanico, facilitando la solubilizzazione dei lipidi e aumentando drasticamente l'efficienza dell'estrazione.

Dopo il processo di estrazione con solvente assistito da ultrasuoni, il risultato è una preparazione di estratto grezzo, chiamata estratto lipidico totale, che viene sottoposta a ulteriore purificazione per consentire l'esame qualitativo e quantitativo delle firme lipidiche. Ora che hai compreso alcuni dei principi fondamentali alla base dell'estrazione lipidica mediante sonicazione, diamo un'occhiata a un protocollo su come viene eseguita la procedura.

Raccogliere i materiali campione necessari da una posizione scelta. Alcuni esempi sono sedimenti lacustri e marini, suoli terrestri, colture microbiche o foglie di piante. Il materiale raccolto viene congelato durante la notte. Successivamente viene liofilizzato in un liofilizzatore per 2 o 3 giorni. Schiacciare e omogeneizzare i campioni liofilizzati prima dell'estrazione con un mortaio e un pestello risciacquati con solvente. Per rimuovere i contaminanti organici, bruciare le pipette di vetro borosilicato necessarie, le fiale e le lattine di pesatura in un forno. Dopo aver permesso alla vetreria di raffreddarsi nel forno, sciacquare gli strumenti metallici con una miscela di diclorometano e metanolo. Una volta preparato il campione e la vetreria, può iniziare la procedura di sonicazione.

Da questo passaggio in poi, tutti i contenitori e le vetreria devono essere bruciati prima dell'uso. Posizionare la teglia su una bilancia e tarare. Risciacquare la spatola da laboratorio con la miscela di solventi, quindi utilizzarla per trasferire una massa appropriata di campione liofilizzato e omogeneizzato nella scatola di pesatura e registrare la massa. Trasferire con attenzione il campione pesato in un flaconcino etichettato. Utilizzando il flacone a spruzzo di DCM:MeOH, aggiungere abbastanza che il campione sia coperto da 1 a 2 cm di solvente e tappare il flaconcino. Posizionare la fiala su un rack impermeabile, ora pronto per la sonicazione. Posizionare il rack direttamente nel bagno di sonicazione. Controllare che il livello dell'acqua nel bagno di sonicazione sia abbastanza profondo da immergere le fiale del campione fino alla parte superiore del solvente di estrazione. Sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la sonicazione, rimuovere il rack dal sonicatore. Lasciare riposare le fiale per consentire l'assestamento dei sedimenti.

Rimuovere la fase superiore del diclorometano-metanolo dal flaconcino di estrazione utilizzando una pipetta e un bulbo e trasferirlo in un altro flaconcino pre-pesato ed etichettato. Ripetere il processo di sonicazione per un totale di tre volte per ogni campione. Raccogliere gli estratti in un flaconcino. Lasciare asciugare i campioni estratti nei loro flaconcini, tappi e nel cappuccio, coperti liberamente con un pezzo di lamina. Etichettare come "residuo estratto" e conservare nel solvente di estrazione. Ora che i biomarcatori sono stati estratti, devono essere purificati prima che l'analisi possa aver luogo.

La sonicazione accelera diversi processi di estrazione con solvente ed è ampiamente utilizzata negli studi geochimici. Molti archeologi lavorano con geochimici per ricostruire le circostanze ambientali e culturali in cui vivevano le prime civiltà umane. La ceramica, una delle più antiche invenzioni umane, una volta portata alla luce, può essere trovata per contenere fossili molecolari residui di vino, riso o altri contenuti che una volta erano conservati all'interno.

Per portare alla luce prove chimiche di sostanze assorbite sulle superfici, piccoli campioni di ceramica vengono sonicati in presenza di solventi organici e i composti estratti possono essere successivamente identificati a valle con metodi spettroscopici. Questo tipo di analisi aiuta gli archeologi a rilevare i tipi di risorse che erano disponibili per le popolazioni antiche e ricostruire le condizioni del loro habitat.

Le microalghe fotosintetiche si trovano negli ecosistemi marini e d'acqua dolce. Poiché crescono in mezzi a base di acqua di mare e la loro cultura occupa aree significativamente più piccole, sono ora ampiamente studiati come un'alternativa promettente alle piante terrestri per la produzione di biocarburanti.

Per estrarre i lipidi da una biomassa microalgale, questi ricercatori descrivono un'estrazione con solvente assistita da sonicazione. La cavitazione acustica durante la sonicazione interrompe efficacemente le pareti cellulari microalgali rigide al fine di liberare i lipidi. Tali tecniche aiutano la caratterizzazione di nuove microalghe dall'ambiente per la produzione di fonti di energia non petrolifere.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'estrazione assistita da sonicazione di biomarcatori dai sedimenti. I seguenti video spiegheranno come l'estratto viene ulteriormente purificato per l'analisi.

Grazie per l'attenzione!

Il primo passo in paleoclimatologia è quello di raccogliere, o estrarre, i biomarcatori dal sedimento in cui si trovano. I campioni ambientali sono composti da componenti non organici, come minerali, acqua e metalli, e componenti organici creati da organismi viventi nell'area. Prima che questi componenti organici possano essere utilizzati dagli scienziati per chiarire le informazioni sul passato, devono essere rimossi dal loro ambiente. La sonicazione, che utilizza onde ultrasoniche, è la più semplice e meno costosa di queste tecniche.

Questo video fa parte di una serie sull'estrazione, la purificazione e l'analisi dei lipidi dai sedimenti. Illustrerà l'estrazione lipidica mediante ultrasuoni e presenterà alcune applicazioni del metodo.

A causa dell'ampia gamma di biomarcatori, non esiste un singolo solvente ottimizzato per estrarli tutti. Questo è riassunto dalla cosiddetta regola "come dissolve come", per cui molecole relativamente apolari si dissolvono in solventi apolari come il diclorometano e più molecole polari si dissolvono in solventi più polari come il metanolo. Le miscele di solventi per l'estrazione di lipidi specifici o gruppi di lipidi sono generalmente ottimizzate empiricamente.

Per accelerare l'estrazione e aumentare la resa, viene utilizzato un sistema di sonicazione per applicare ultrasuoni - onde con frequenze superiori a 20 kHz, in combinazione con la miscela di solvente. Quando queste onde entrano in contatto con la fase organica liquida, causano la formazione di microbolle di breve durata di vapori di solvente che crescono e collassano rapidamente. Al collasso, queste bolle rilasciano un'enorme quantità di energia come taglio meccanico, facilitando la solubilizzazione dei lipidi e aumentando drasticamente l'efficienza dell'estrazione.

Dopo il processo di estrazione con solvente assistito da ultrasuoni, il risultato è una preparazione di estratto grezzo, chiamata estratto lipidico totale, che viene sottoposta a ulteriore purificazione per consentire l'esame qualitativo e quantitativo delle firme lipidiche. Ora che hai compreso alcuni dei principi fondamentali alla base dell'estrazione lipidica mediante sonicazione, diamo un'occhiata a un protocollo su come viene eseguita la procedura.

Raccogliere i materiali campione necessari da una posizione scelta. Alcuni esempi sono sedimenti lacustri e marini, suoli terrestri, colture microbiche o foglie di piante. Il materiale raccolto viene congelato durante la notte. Successivamente viene liofilizzato in un liofilizzatore per 2 o 3 giorni. Schiacciare e omogeneizzare i campioni liofilizzati prima dell'estrazione con un mortaio e un pestello risciacquati con solvente. Per rimuovere i contaminanti organici, bruciare le pipette di vetro borosilicato necessarie, le fiale e le lattine di pesatura in un forno. Dopo aver permesso alla vetreria di raffreddarsi nel forno, sciacquare gli strumenti metallici con una miscela di diclorometano e metanolo. Una volta preparato il campione e la vetreria, può iniziare la procedura di sonicazione.

Da questo passaggio in poi, tutti i contenitori e le vetreria devono essere bruciati prima dell'uso. Posizionare la teglia su una bilancia e tarare. Risciacquare la spatola da laboratorio con la miscela di solventi, quindi utilizzarla per trasferire una massa appropriata di campione liofilizzato e omogeneizzato nella scatola di pesatura e registrare la massa. Trasferire con attenzione il campione pesato in un flaconcino etichettato. Utilizzando il flacone a spruzzo di DCM:MeOH, aggiungere abbastanza che il campione sia coperto da 1 a 2 cm di solvente e tappare il flaconcino. Posizionare la fiala su un rack impermeabile, ora pronto per la sonicazione. Posizionare il rack direttamente nel bagno di sonicazione. Controllare che il livello dell'acqua nel bagno di sonicazione sia abbastanza profondo da immergere le fiale del campione fino alla parte superiore del solvente di estrazione. Sonicare per 30 minuti a temperatura ambiente. Dopo la sonicazione, rimuovere il rack dal sonicatore. Lasciare riposare le fiale per consentire l'assestamento dei sedimenti.

Rimuovere la fase superiore del diclorometano-metanolo dal flaconcino di estrazione utilizzando una pipetta e un bulbo e trasferirlo in un altro flaconcino pre-pesato ed etichettato. Ripetere il processo di sonicazione per un totale di tre volte per ogni campione. Raccogliere gli estratti in un flaconcino. Lasciare asciugare i campioni estratti nei loro flaconcini, tappi e nel cappuccio, coperti liberamente con un pezzo di lamina. Etichettare come "residuo estratto" e conservare nel solvente di estrazione. Ora che i biomarcatori sono stati estratti, devono essere purificati prima che l'analisi possa aver luogo.

La sonicazione accelera diversi processi di estrazione con solvente ed è ampiamente utilizzata negli studi geochimici. Molti archeologi lavorano con geochimici per ricostruire le circostanze ambientali e culturali in cui vivevano le prime civiltà umane. La ceramica, una delle più antiche invenzioni umane, una volta portata alla luce, può essere trovata per contenere fossili molecolari residui di vino, riso o altri contenuti che una volta erano conservati all'interno.

Per portare alla luce prove chimiche di sostanze assorbite sulle superfici, piccoli campioni di ceramica vengono sonicati in presenza di solventi organici e i composti estratti possono essere successivamente identificati a valle con metodi spettroscopici. Questo tipo di analisi aiuta gli archeologi a rilevare i tipi di risorse che erano disponibili per le popolazioni antiche e ricostruire le condizioni del loro habitat.

Le microalghe fotosintetiche si trovano negli ecosistemi marini e d'acqua dolce. Poiché crescono in mezzi a base di acqua di mare e la loro cultura occupa aree significativamente più piccole, sono ora ampiamente studiati come un'alternativa promettente alle piante terrestri per la produzione di biocarburanti.

Per estrarre i lipidi da una biomassa microalgale, questi ricercatori descrivono un'estrazione con solvente assistita da sonicazione. La cavitazione acustica durante la sonicazione interrompe efficacemente le pareti cellulari microalgali rigide al fine di liberare i lipidi. Tali tecniche aiutano la caratterizzazione di nuove microalghe dall'ambiente per la produzione di fonti di energia non petrolifere.

Hai appena visto l'introduzione di JoVE all'estrazione assistita da sonicazione di biomarcatori dai sedimenti. I seguenti video spiegheranno come l'estratto viene ulteriormente purificato per l'analisi.

Grazie per l'attenzione!