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침전물에서 지질 생물지표의 초음파 추출
 
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침전물에서 지질 생물지표의 초음파 추출

Overview

출처: 제프 살라컵 연구소 - 매사추세츠 대학교 애머스트

임의의 생태계(잎, 곰팡이, 껍질, 조직)의 살아있는 "유기" 점유율을 포함하는 물질; 그림 1) 비생활 "무기"공유 (바위와 그 성분 미네랄, 산소, 물, 금속)의 재료와 근본적으로 다릅니다. 유기 물질은 무기 물질과 구별되는 일련의 다른 탄소 및 수소 분자(그림 2)에연결된 탄소를 포함합니다. 탄소의 넓은 발리언스 범위(-4 ~ +4)를 사용하면 인접한 원자, 보통 C, H, O, N, S 및 P와 최대 4개의 개별 공유 결합을 형성할 수 있습니다. 또한 종종 유독한 시안화물 또는 니트릴 그룹의 삼중 결합과 같은 단일 다른 원자와 최대 3 개의 공유 결합을 공유 할 수 있습니다. 지난 46억 년 동안 이러한 유연성은 크기, 복잡성, 극성, 모양 및 기능면에서 다양한 화학 구조물을 만들어 냈습니다. 유기 지질 화학의 과학 분야는 지질 학적 시간을 통해이 행성뿐만 아니라 다른 사람에 의해 생성 된 바이오 마커라고 불리는 검출 가능한 유기 화합물의 전체 범위의 식별 및 특성화에 관한 것입니다.

Figure 1
그림 1. 나무, 잎, 이끼와 같은 유기 물질은 포장과 같은 무기 재료와 화학적이고 시각적으로 구별됩니다.

Principles

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초음파 처리를 통한 추출은 주어진 샘플로부터 총 지질 추출물(TLE)을 얻는 가장 간단하고 저렴한 방법이며, 이 방법과 관련된 회복은 다른 보다 정교한 기술과 동등하다. 그것은 유기 용매의 존재에 유리병에 샘플을 동요하기 위해 초음파 목욕을 사용합니다. 시료에 포함된 바이오마커는 유기 화합물을 사용하는 용해도 규칙에 따라 유기상으로 용해되며, 이는 주로 바이오마커와 용매 모두의 극성에 의해 제어된다. 이것은 소위 '같은 용해'규칙에 의해 요약된다, 이에 의해 상대적으로 극성 바이오 마커 (독점적으로 C와 H를 포함하는 사람들; isoprene) 극성 용매 (예 : 헥산, 극성 = 0.1) 및 더 많은 극성 바이오 마커 (O, N, S, P를 포함하는 것)에 용해 (O, N, S, P; 글리세롤 글리세롤 - 테트라테어 (GDGT의)) 더 많은 극성 용매에 용해 (메탄올 또는 디클로로 메탄, 극성 등). 사실, 이것은 바이오마커의 상이한 그룹의 분리가 극성에서 극성까지, 각각 시료로부터 더 많은 극성 화합물을 추출하는 일련의 용매의 도입을 통해 달성될 수 있는 첫 번째 단계이다. 따라서 표적 퇴적물의 순차적 추출물로부터의 용매는 따라서 별도로 분석되거나 결합하여 나중에 정제될 수 있는 총 지질 추출물(TLE)을 형성할 수 있다.

고생물학의 첫 번째 단계는 그들이 발견되는 퇴적물에서 바이오 마커를 수집하거나 추출하는 것입니다. 환경 샘플은 미네랄, 물 및 금속과 같은 비유기 성분과 이 지역의 살아있는 유기체에 의해 생성되는 유기 성분으로 구성됩니다. 이러한 유기 성분은 과학자들에 의해 과거에 대한 정보를 해명하기 위해 사용되기 전에, 그들은 그들의 환경에서 제거해야합니다. 초음파를 사용하는 초음파 는 이러한 기술 중 가장 간단하고 저렴한 것입니다.

이 비디오는 지질 추출, 정제 및 퇴적물분석시리즈의 일부입니다. 그것은 초음파에 의한 지질 추출을 설명하고 방법의 몇 가지 응용 프로그램을 제시할 것입니다.

광범위한 바이오마커로 인해 모든 것을 추출하도록 최적화된 단일 용매는 없습니다. 이것은 소위 '용해와 같은' 규칙에 의해 요약되며, 이에 따라 상대적으로 극성 분자가 디클로로메탄과 같은 극성 용매에 용해되고, 더 많은 극성 분자가 메탄올과 같은 더 많은 극성 용매에 용해된다. 특정 지질 또는 지질 그룹의 추출을 위한 용매 혼합물은 일반적으로 경험적으로 최적화된다.

추출을 가속화하고 수율을 높이기 위해 초음파 처리 시스템이 용매 혼합물과 함께 20kHz 이상의 주파수를 가진 초음파를 적용하는 데 사용됩니다. 이러한 파도가 액체 유기 상에 접촉하면 빠르게 성장하고 붕괴되는 용매 증기의 단명 한 마이크로 버블형성이 발생합니다. 붕괴시, 이 거품은 기계적 전단으로서 엄청난 양의 에너지를 방출하여 지질 용해제를 촉진하고 추출 효율을 크게 증가시다.

초음파 보조 용매 추출 과정 후, 그 결과는 지질 서명의 질적 및 정량적 검사를 허용하기 위해 추가 정화를 실시하는 총 지질 추출물이라고 불리는 조질 추출물 제제입니다. 이제 초음파 처리에 의한 지질 추출의 주요 원칙 중 일부를 이해되었으므로 절차가 수행되는 방법에 대한 프로토콜을 살펴 볼 수 있습니다.

선택한 위치에서 필요한 샘플 재료를 수집합니다. 일부 예로는 락서스트린과 해양 퇴적물, 지상 토양, 미생물 배양 또는 식물 잎이 있습니다. 수집된 재료는 하룻밤 사이에 동결됩니다. 이에 따라 2~3일 동안 동결 건조기에서 동결 건조됩니다. 용매 린 모르타르와 페슬을 추출하기 전에 동결 건조 된 샘플을 분쇄하고 균질화하십시오. 유기 오염 물질을 제거하기 위해 필요한 보로실리케이트 유리 파이펫, 바이알 및 오븐에서 계량 주석을 연소시합니다. 유리제품이 오븐에서 식을 수 있게 한 후, 디클로로메탄과 메탄올이 혼합된 금속 공구를 헹구세요. 샘플과 유리 제품이 준비되면 초음파 처리 절차가 시작될 수 있습니다.

이 단계에서는 모든 용기와 유리 제품을 사용하기 전에 연소해야 합니다. 계량 주석을 스케일에 놓고 타레를 놓습니다. 용매 혼합물로 실험실 주걱을 헹구고, 동결 건조, 균질화 된 시료의 적절한 질량을 계량 주석으로 전송하고 질량을 기록하는 데 사용합니다. 계량된 샘플을 라벨이 부착된 바이알로 조심스럽게 전송합니다. DCM:MeOH의 분출 병을 사용하여 샘플이 용매의 1 ~2cm로 덮여 있을 만큼 충분히 추가하고 유리병을 캡합니다. 이제 초음파 처리 할 준비가방수 랙에 유리병을 배치합니다. 랙을 초음파 욕조에 직접 넣습니다. 초음파 처리 욕조의 수위가 추출 용매의 상단까지 샘플 바이알을 담그기에 충분히 깊이 있는지 확인하십시오. 실온에서 30분 간 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 초음파 처리기에서 랙을 제거합니다. 바이알이 앉아 퇴적물 침전이 발생할 수 있도록 하십시오.

피펫과 전구를 사용하여 추출 바이알에서 디클로로메탄 메탄올 상부 상을 제거하고, 다른 미리 계량되고 표지된 바이알로 옮김합니다. 각 샘플에 대해 초음파 처리과정을 총 3회 반복한다. 추출물을 하나의 유리병으로 수집합니다. 추출된 샘플이 바이알에서 건조하고, 뚜껑을 벗기고, 후드에 호일로 느슨하게 덮어 두어 두드립니다. '추출된 잔류물'으로 라벨을 부착하고 추출 용매에 보관하십시오. 이제 바이오마커가 추출되었으므로 분석이 이루어지기 전에 정제되어야 합니다.

초음파 처리는 여러 용매 추출 공정을 가속화하고 널리 지구 화학 연구에 사용된다. 많은 고고학자들은 초기 인류 문명이 살았던 환경 및 문화적 상황을 재구성하기 위해 지구화학자와 협력합니다. 가장 오래된 인간 발명품 중 하나인 도자기는 발굴될 때 와인, 쌀 또는 한때 저장되었던 다른 내용물에서 잔류 분자 화석을 함유하고 있는 것으로 나타났습니다.

표면에 흡수된 물질의 화학적 증거를 발굴하기 위해, 도자기의 작은 샘플은 유기 용매의 존재에 초음파 처리되고 추출된 화합물은 분광 방법에 의해 하류로 확인할 수 있다. 이러한 종류의 분석은 고고학자가 고대 인구가 사용할 수 있는 자원의 종류를 감지하고 서식지의 조건을 재구성하는 데 도움이 됩니다.

광합성 미세조류는 해양 및 담수 생태계에서 발견됩니다. 그들은 해수 기반 미디어에서 성장하고 그들의 문화는 상당히 작은 영역을 차지하기 때문에, 그들은 지금 널리 바이오 연료의 생산을위한 지상 식물에 대한 유망한 대안으로 연구되고있다.

미세 조류 바이오 매스에서 지질을 추출하기 위해, 이 연구원은 초음파 처리 보조 용매 추출을 기술합니다. 초음파 처리 중 음향 캐비테이션은 지질을 해방하기 위해 강성 미세 조류 세포벽을 효과적으로 방해합니다. 이러한 기술은 비 석유 에너지원의 생산을 위한 환경으로부터 새로운 미세조류의 특성화를 돕습니다.

당신은 방금 퇴적물에서 바이오 마커의 초음파 지원 추출에 JoVE의 소개를 보았다. 다음 비디오는 분석을 위해 추출물이 어떻게 더 정제되는지 설명합니다.

시청해 주셔서 감사합니다!

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Procedure

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1. 필요한 재료 수집

  1. 샘플 (잎, 먼지, 곰팡이, 껍질, 조직), 일반적으로 냉동, 동결 건조, 분쇄, 및 추출 하기 전에 균질화, 효율성을 극대화 하기 위해 그룹으로 추출. 세 가지 샘플을 추출합니다.
  2. 샘플의 크기에 따라 4-60mL에 이르는 부피를 가진 바이알이 사용될 수 있다. 이 실험을 위해, 보로실리케이트 유리 바이알(40mL) 및 용매 안전 캡이 사용된다. 바이알, 보로실리케이트 유리 파이펫 및 계량 주석은 가능한 유기 오염 물질을 제거하기 전에 6 시간 동안 550 °C에서 연소되어야합니다.
  3. 디클로로메탄과 메탄올은 대부분의 유기 지질 화학 실험실에서 일반적입니다. 그들은 사용하기 전에 실험실 도구와 유리 제품을 헹구기 위해 개별적으로 사용됩니다. 메탄올(MeOH; 9:1)에 디클로로메탄(DCM)의 혼합물이 많은 실험실에서 사용되어 광범위한 극성을 가진 바이오마커를 효율적으로 추출합니다. 용매는 유기 오염 물질이 없어야합니다.
  4. 실온에서 초음파 처리 물 목욕을 사용합니다. 주요 과학 장비 소매업체에서 열 유무에 관계없이 다양한 초음파 장치 크기와 초음파 처리가 가능합니다.
  5. 방수해야 바이알 랙은 초음파 욕조에 배치됩니다.
  6. 용매 승인 화학 후드.

2. 샘플 준비

  1. 연소된 계량 주석을 실험실 규모에 놓고 용기를 놓습니다.
  2. 용매로 실험실 주걱을 헹구고 적절한 양의 샘플을 계량 주석으로 전송하고 질량을 기록합니다.
    1. 샘플의 질량은 유기물 함량에 따라 다릅니다. 상대적으로 유기물질 린(marine mud)은 여러 그램을 필요로 할 수 있으며, 유기물질이 풍부한 물질(잎 조직)은 훨씬 적게 필요할 수 있다.
  3. 계량 주석의 모든 재료를 연소, 사전 계량 및 라벨이 부착된 바이알로 전송합니다. 바이알을 캡한 다음 계량 주석을 버립니다.
  4. 추출할 각 샘플에 대해 2.1 - 2.3 단계를 수행합니다.

3. 추출

  1. 전연소 파이펫과 전구를 사용하여 DCM:MeOH(9:1) 혼합물을 각 바이알로 ~20mL를 전송합니다(바이알은 약 절반정도 가득 있어야 함). 다음 샘플로 이동하기 전에 리캡 바이알을 다시 덮어 주므로 휘발성 용매가 증발하지 않습니다.
    1. DCM과 MeOH의 변동성은 다릅니다. 미수 시료 바이알로 인한 추출 용매의 증발은 극성을 변화시키고 따라서 추출할 수 있다.
  2. 샘플 바이알을 방수 바이알 랙에 넣습니다.
  3. 초음파 처리 욕조의 수위는 추출 용매의 상단까지 샘플 바이알을 침수 할 만큼 깊은지 확인하십시오. 물이 너무 많으면 바이알이 떠있을 수 있습니다. 물이 너무 적어 시료가 제대로 교반되는 것을 막을 수 있습니다.
  4. 유리병 랙에 샘플이 있는 유리병을 초음파 욕조에 직접 놓습니다.
  5. 실온에서 30분 동안 초음파 처리합니다.
  6. 초음파 처리기에서 샘플 랙을 제거합니다. 퇴적물을 추출하는 경우 정착이 발생할 수 있도록 30 분 동안 설정하십시오. 샘플의 다른 세트를 추출하는 경우,이 시간에 초음파 처리기에 넣어.
  7. DCM:MeOH 혼합물을 추출 유리병에서 제거하고, 연소 전구와 전구를 사용하여, 다른 사전 계량, 사전 연소 및 라벨이 부착된 40mL 바이알에 삽입한다.
  8. 모든 샘플에 대해 3.1 - 3.7 3배 반복하십시오.
  9. 추출된 샘플이 바이알에서 건조하고, 뚜껑을 벗기고, 후드에 호일로 느슨하게 덮어 두어 두드립니다. '추출된 잔류물'으로 라벨을 붙이고 보관하십시오.
  10. 각 샘플에 대해 결합된 추출물을 'TLE'로 레이블을 지정합니다.

고생물학의 첫 번째 단계는 그들이 발견되는 퇴적물에서 바이오 마커를 수집하거나 추출하는 것입니다. 환경 샘플은 미네랄, 물 및 금속과 같은 비유기 성분과 이 지역의 살아있는 유기체에 의해 생성되는 유기 성분으로 구성됩니다. 이러한 유기 성분은 과학자들에 의해 과거에 대한 정보를 해명하기 위해 사용되기 전에, 그들은 그들의 환경에서 제거해야합니다. 초음파를 사용하는 초음파 는 이러한 기술 중 가장 간단하고 저렴한 것입니다.

이 비디오는 지질 추출, 정제 및 퇴적물분석시리즈의 일부입니다. 그것은 초음파에 의한 지질 추출을 설명하고 방법의 몇 가지 응용 프로그램을 제시할 것입니다.

광범위한 바이오마커로 인해 모든 것을 추출하도록 최적화된 단일 용매는 없습니다. 이것은 소위 '용해와 같은' 규칙에 의해 요약되며, 이에 따라 상대적으로 극성 분자가 디클로로메탄과 같은 극성 용매에 용해되고, 더 많은 극성 분자가 메탄올과 같은 더 많은 극성 용매에 용해된다. 특정 지질 또는 지질 그룹의 추출을 위한 용매 혼합물은 일반적으로 경험적으로 최적화된다.

추출을 가속화하고 수율을 높이기 위해 초음파 처리 시스템이 용매 혼합물과 함께 20kHz 이상의 주파수를 가진 초음파를 적용하는 데 사용됩니다. 이러한 파도가 액체 유기 상에 접촉하면 빠르게 성장하고 붕괴되는 용매 증기의 단명 한 마이크로 버블형성이 발생합니다. 붕괴시, 이 거품은 기계적 전단으로서 엄청난 양의 에너지를 방출하여 지질 용해제를 촉진하고 추출 효율을 크게 증가시다.

초음파 보조 용매 추출 과정 후, 그 결과는 지질 서명의 질적 및 정량적 검사를 허용하기 위해 추가 정화를 실시하는 총 지질 추출물이라고 불리는 조질 추출물 제제입니다. 이제 초음파 처리에 의한 지질 추출의 주요 원칙 중 일부를 이해되었으므로 절차가 수행되는 방법에 대한 프로토콜을 살펴 볼 수 있습니다.

선택한 위치에서 필요한 샘플 재료를 수집합니다. 일부 예로는 락서스트린과 해양 퇴적물, 지상 토양, 미생물 배양 또는 식물 잎이 있습니다. 수집된 재료는 하룻밤 사이에 동결됩니다. 이에 따라 2~3일 동안 동결 건조기에서 동결 건조됩니다. 용매 린 모르타르와 페슬을 추출하기 전에 동결 건조 된 샘플을 분쇄하고 균질화하십시오. 유기 오염 물질을 제거하기 위해 필요한 보로실리케이트 유리 파이펫, 바이알 및 오븐에서 계량 주석을 연소시합니다. 유리제품이 오븐에서 식을 수 있게 한 후, 디클로로메탄과 메탄올이 혼합된 금속 공구를 헹구세요. 샘플과 유리 제품이 준비되면 초음파 처리 절차가 시작될 수 있습니다.

이 단계에서는 모든 용기와 유리 제품을 사용하기 전에 연소해야 합니다. 계량 주석을 스케일에 놓고 타레를 놓습니다. 용매 혼합물로 실험실 주걱을 헹구고, 동결 건조, 균질화 된 시료의 적절한 질량을 계량 주석으로 전송하고 질량을 기록하는 데 사용합니다. 계량된 샘플을 라벨이 부착된 바이알로 조심스럽게 전송합니다. DCM:MeOH의 분출 병을 사용하여 샘플이 용매의 1 ~2cm로 덮여 있을 만큼 충분히 추가하고 유리병을 캡합니다. 이제 초음파 처리 할 준비가방수 랙에 유리병을 배치합니다. 랙을 초음파 욕조에 직접 넣습니다. 초음파 처리 욕조의 수위가 추출 용매의 상단까지 샘플 바이알을 담그기에 충분히 깊이 있는지 확인하십시오. 실온에서 30분 간 초음파 처리합니다. 초음파 처리 후 초음파 처리기에서 랙을 제거합니다. 바이알이 앉아 퇴적물 침전이 발생할 수 있도록 하십시오.

피펫과 전구를 사용하여 추출 바이알에서 디클로로메탄 메탄올 상부 상을 제거하고, 다른 미리 계량되고 표지된 바이알로 옮김합니다. 각 샘플에 대해 초음파 처리과정을 총 3회 반복한다. 추출물을 하나의 유리병으로 수집합니다. 추출된 샘플이 바이알에서 건조하고, 뚜껑을 벗기고, 후드에 호일로 느슨하게 덮어 두어 두드립니다. '추출된 잔류물'으로 라벨을 부착하고 추출 용매에 보관하십시오. 이제 바이오마커가 추출되었으므로 분석이 이루어지기 전에 정제되어야 합니다.

초음파 처리는 여러 용매 추출 공정을 가속화하고 널리 지구 화학 연구에 사용된다. 많은 고고학자들은 초기 인류 문명이 살았던 환경 및 문화적 상황을 재구성하기 위해 지구화학자와 협력합니다. 가장 오래된 인간 발명품 중 하나인 도자기는 발굴될 때 와인, 쌀 또는 한때 저장되었던 다른 내용물에서 잔류 분자 화석을 함유하고 있는 것으로 나타났습니다.

표면에 흡수된 물질의 화학적 증거를 발굴하기 위해, 도자기의 작은 샘플은 유기 용매의 존재에 초음파 처리되고 추출된 화합물은 분광 방법에 의해 하류로 확인할 수 있다. 이러한 종류의 분석은 고고학자가 고대 인구가 사용할 수 있는 자원의 종류를 감지하고 서식지의 조건을 재구성하는 데 도움이 됩니다.

광합성 미세조류는 해양 및 담수 생태계에서 발견됩니다. 그들은 해수 기반 미디어에서 성장하고 그들의 문화는 상당히 작은 영역을 차지하기 때문에, 그들은 지금 널리 바이오 연료의 생산을위한 지상 식물에 대한 유망한 대안으로 연구되고있다.

미세 조류 바이오 매스에서 지질을 추출하기 위해, 이 연구원은 초음파 처리 보조 용매 추출을 기술합니다. 초음파 처리 중 음향 캐비테이션은 지질을 해방하기 위해 강성 미세 조류 세포벽을 효과적으로 방해합니다. 이러한 기술은 비 석유 에너지원의 생산을 위한 환경으로부터 새로운 미세조류의 특성화를 돕습니다.

당신은 방금 퇴적물에서 바이오 마커의 초음파 지원 추출에 JoVE의 소개를 보았다. 다음 비디오는 분석을 위해 추출물이 어떻게 더 정제되는지 설명합니다.

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Results

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추출의 끝에서, 각 샘플에 대한 총 지질 추출물 (TLE)이 분명하다. 각 바이알은 퇴적물, 토양 또는 식물 조직에서 추출 가능한 유기물을 포함합니다. 이러한 TL은 이제 분석될 수 있으며 화학 성분을 식별하고 정량화할 수 있습니다.

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Applications and Summary

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바이오마커의 다른 클래스는 지구 시스템의 특정 측면에 대한 정보를 제공합니다. 예를 들어, 유년기에서 유기 지구화학은 주로 석유의 형성, 이주 및 변경에 관심을 가지었으며, 오늘날 유기 지구화학자가 사용하는 많은 화학 도구는 초기 조사를 기반으로 합니다. 이소페노이드라는 화합물의 클래스의 조사를 통해, 반복 다섯 탄소 패턴(그림 2)을갖는, 과학자들은 석유가 바다에서 플랑크톤 (석유로 변환, 도 3)또는 땅에 토탄 늪 (석탄, 그림 4)와같은 고대 주요 생산자의 화학적으로 변경 된 유적을 구성 발견. 대형 석유 회사의 화학자들은 다양한 화합물의 비율을 사용했는데, 각각 자체적으로 알려진 변경 률을 가진 석유가 얼마나 오래되었는지, 어디에서 왔는지, 그리고 악용할 가치가 있는지 추정했습니다. 오늘날, 새로운 바이오마커가 전 세계 유기 지구화학 실험실에서 분석된 현대 및 고대 샘플에서 발견, 식별 및 특징화되고 있습니다. 오늘날의 많은 응용 분야는 과거의 기후, 환경 및 생태계를 재구성하기 위한 노력의 일환으로 바이오마커의 유틸리티를 고대 퇴적물로 확장하기 위해 현대 샘플(잎, 토양, 미생물, 물 샘플 등)에서 얻은 바이오마커로부터 환경 정보를 추출하고자 합니다. 예를 들어, 글리세롤-다이얼킬 글리세롤-테트라에테너(GDGT)라고 불리는 바이오마커 그룹의 분포는 고고학 및 박테리아 제품군에 의해 생성된 현대 퇴적물에서 공기 또는 수온에 대응하여 예측 가능한 방식으로 변화하는 것으로 나타났다. 따라서 고대 퇴적물에 이러한 바이오마커의 분포를 사용하거나 알려진 시대의 일련의 퇴적물을 통해 공기와 수온을 재구성하여 수백만 년 전으로 거슬러 올라올 수 있다.

Figure 2
그림 2. 이소프렌은 5개의 탄소 원자와 2개의 이중 결합으로 구성됩니다. 생합성 반응에 함께 추가 될 때, 그들은 삶의 존재를위한 복잡한 분자 진단을 형성 할 수 있습니다. 예를 들면, 2, 6,10,15,19-펜타메틸레이코사네, 일반적으로 시아노균 매트에서 찾아냅니다.

Figure 3
그림 3. 몰디브에서 플랑크톤의 조명. 저작권 PawelG 사진.

Figure 4
그림 4. 에콰도르 안데스의 4,500m 고도에서 토탄 늪. 저작권 박사 몰리 읽기

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Transcript

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