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Extração de sônicação de biomarcadores lipídicos de sedimentos
 
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Extração de sônicação de biomarcadores lipídicos de sedimentos

Overview

Fonte: Laboratório de Jeff Salacup - Universidade de Massachusetts Amherst

O material que compreende a parcela "orgânica" viva de qualquer ecossistema (folhas, fungos, casca, tecido; Figura 1) difere fundamentalmente do material da parte "inorgânica" não viva (rochas e seus minerais constituintes, oxigênio, água, metais). O material orgânico contém carbono ligado a uma série de outras moléculas de carbono e hidrogênio(Figura 2),que o distingue do material inorgânico. A ampla faixa de valency do carbono (-4 a +4) permite formar até quatro ligações covalentes separadas com átomos vizinhos, geralmente C, H, O, N, S e P. Ele também pode compartilhar até três ligações covalentes com um único outro átomo, como a ligação tripla no grupo de cianeto muitas vezes venenoso, ou nitrito. Nos últimos 4,6 bilhões de anos, essa flexibilidade levou a uma incrível variedade de estruturas químicas, que variam em tamanho, complexidade, polaridade, forma e função. O campo científico da geoquímica orgânica está preocupado com a identificação e caracterização de toda a gama de compostos orgânicos detectáveis, chamados biomarcadores, produzidos pela vida neste planeta, bem como outros, através do tempo geológico.

Figure 1
Figura 1. Materiais orgânicos, como árvores, folhas e musgo, são quimicamente e visualmente distintos de materiais inorgânicos, como o pavimento.

Principles

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A extração via sônica é o método mais simples e menos caro de obter um extrato lipídeca total (TLE) de uma determinada amostra, e a recuperação associada a este método está em par com outras técnicas mais sofisticadas. Ele usa um banho ultrassônico para agitar uma amostra em um frasco na presença de solvente orgânico. Os biomarcadores contidos na amostra dissolvem-se na fase orgânica com base nas regras da solubilidade, que com compostos orgânicos, são controlados principalmente pela polaridade tanto do biomarcador quanto do solvente. Isso é resumido pela chamada regra "como dissolves like", pela qual biomarcadores relativamente apolares (aqueles que contêm exclusivamente C e H; isoprene) dissolvem-se em solventes apolares (como hexano, polaridade = 0,1) e mais biomarcadores polares (aqueles que contêm O, N, S, P; glicerol-dialkyl-tetraethers (GDGT's)) dissolvem-se em solventes mais polares (como metanol ou dichlorometano, polaridade = 5,1 e 3,1). Na verdade, este é o primeiro passo em que a separação de diferentes grupos de biomarcadores pode ser alcançada através da introdução de uma série de solventes, do apolar ao polar, cada um extraindo cada vez mais compostos polares da amostra. Os solventes de extratos sequenciais de um sedimento alvo podem, portanto, ser analisados separadamente ou combinados para formar um extrato lipídedo total (TLE) que pode ser purificado posteriormente.

O primeiro passo na paleoclimatologia é coletar, ou extrair, os biomarcadores do sedimento em que são encontrados. As amostras ambientais são compostas de componentes não orgânicos, como minerais, água e metais, e componentes orgânicos que são criados por organismos vivos na área. Antes que esses componentes orgânicos possam ser usados pelos cientistas para elucidar informações sobre o passado, eles devem ser removidos de seu ambiente. A sonicação, que utiliza ondas ultrassônicas, é a mais simples e menos cara dessas técnicas.

Este vídeo faz parte de uma série sobre extração lipídica, purificação e análise de sedimentos. Ilustrará a extração lipídica por ultrassom e apresentará algumas aplicações do método.

Devido à ampla gama de biomarcadores, não há um único solvente otimizado para extrair todos eles. Isso é resumido pela regra chamada "como dissolve como as", pela qual moléculas relativamente apolares se dissolvem em solventes apolares, como o diclorometano, e mais moléculas polares se dissolvem em solventes mais polares, como o metanol. Misturas de solventes para a extração de lipídios específicos ou grupos de lipídios são geralmente otimizadas empiricamente.

Para acelerar a extração e aumentar o rendimento, um sistema de sônica é usado para aplicar ultrassom - ondas com frequências superiores a 20 kHz, em conjunto com a mistura de solventes. Quando essas ondas entram em contato com a fase orgânica líquida, causam a formação de microbolhas de curta duração de vapores solventes que crescem rapidamente e entram em colapso. Em colapso, essas bolhas liberam uma enorme quantidade de energia como tesoura mecânica, facilitando a solubilização lipídica e aumentando drasticamente a eficiência da extração.

Após o processo de extração assistida por solventes, o resultado é uma preparação de extrato bruto, chamada extrato lipídudo total, que é submetida a uma purificação adicional para permitir o exame qualitativo e quantitativo de assinaturas lipídicas. Agora que você entende alguns dos principais princípios por trás da extração lipídica por sônica, vamos dar uma olhada em um protocolo de como o procedimento é realizado.

Colete os materiais amostrais necessários a partir de um local escolhido. Alguns exemplos são lacotrinas e sedimentos marinhos, solos terrestres, culturas microbianas ou folhas de plantas. O material coletado é congelado durante a noite. Depois disso, é congelado em uma secadora congelante por 2 a 3 dias. Esmague e homogeneize as amostras congeladas antes da extração com argamassa e pilão de solvente. Para remover contaminantes orgânicos, combustão as pipetas de vidro borossilicatas necessárias, frascos e latas de pesagem em um forno. Depois de permitir que o vidro esfrie no forno, enxágue as ferramentas metálicas com uma mistura de diclorometano e metanol. Uma vez que a amostra e os vidros são preparados, o procedimento de sônica pode começar.

A partir deste passo, todos os recipientes e vidros devem ser queimados antes de serem usados. Coloque a lata de pesagem em uma balança e tare. Enxágüe a espátula de laboratório com a mistura de solventes, então, use-a para transferir uma massa apropriada de amostra congelada e homogeneizada para a lata de pesagem e registe a massa. Transfira cuidadosamente a amostra pesada para um frasco rotulado. Usando a garrafa de esguicho de DCM:MeOH, adicione o suficiente para que a amostra esteja coberta por 1 a 2 cm de solvente e tampa o frasco. Coloque o frasco em um rack impermeável, agora pronto para a sônicação. Coloque o rack diretamente no banho de sônica. Verifique se o nível de água no banho de sônica é apenas profundo o suficiente para submergir os frascos de amostra até o topo do solvente de extração. Sonicate por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a sônicação, remova o rack do sonicator. Deixe os frascos sentarem-se para permitir que a fixação de sedimentos ocorra.

Remova a fase superior de diclorometano-metanol do frasco de extração usando uma pipeta e lâmpada, e transfira para outro frasco pré-pesado e rotulado. Repita o processo de sônica um total de três vezes para cada amostra. Colete os extratos em um frasco. Deixe as amostras extraídas secarem em seus frascos, tampas fora, e no capô, cobertos livremente com um pedaço de papel alumínio. Rotular como 'resíduo extraído' e armazenar no solvente de extração. Agora que os biomarcadores foram extraídos, eles devem ser purificados antes que a análise possa ocorrer.

A sônica acelera vários processos de extração de solventes e é amplamente utilizada em estudos geoquímicos. Muitos arqueólogos trabalham com geoquímicos para reconstruir as circunstâncias ambientais e culturais sob as quais as civilizações humanas primitivas viviam. A cerâmica, uma das mais antigas invenções humanas, quando desenterrada, pode ser encontrada para conter fósseis moleculares residuais de vinho, arroz ou outros conteúdos que já foram armazenados dentro.

Para desenterrar evidências químicas de substâncias absorvidas nas superfícies, pequenas amostras de cerâmica são sônicas na presença de solventes orgânicos e compostos extraídos podem ser posteriormente identificados rio abaixo por métodos espectroscópicos. Esse tipo de análise ajuda os arqueólogos a detectar os tipos de recursos disponíveis para populações antigas e reconstruir as condições de seu habitat.

Microalgas fotossintéticas são encontradas em ecossistemas marinhos e de água doce. Como crescem na mídia baseada em água do mar e sua cultura ocupa áreas significativamente menores, eles agora estão sendo amplamente estudados como uma alternativa promissora às plantas terrestres para a produção de biocombustíveis.

Para extrair lipídios de uma biomassa microálgica, esses pesquisadores descrevem uma extração de solvente assistida por sônica. A cavitação acústica durante a sônica efetivamente interrompe paredes de células microánguas rígidas, a fim de liberar lipídios. Tais técnicas auxiliam na caracterização de novas microalgas do meio ambiente para a produção de fontes de energia não petrolíferas.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à Extração Assistida por Biomarcadores de Sedimentos. Os vídeos a seguir explicarão como o extrato é purificado para análise.

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Procedure

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1. Recolher os materiais necessários

  1. Amostras (folhas, sujeira, fungos, casca, tecido), geralmente congeladas, congeladas, esmagadas e homogeneizadas antes da extração, extraídas em grupos para maximizar a eficiência. Extraia três amostras.
  2. Dependendo do tamanho da amostra, podem ser utilizados frascos com volumes que variam de 4 a 60 mL. Para este experimento, são utilizados frascos de vidro borossilicato (40 mL) e tampas seguras de solventes. Frascos, pipetas de vidro borossilicato e latas de pesagem devem ser queimados a 550 °C por 6h antes de garantir a remoção de possíveis contaminantes orgânicos.
  3. Diclorometano e metanol são comuns na maioria dos laboratórios de geoquímica orgânica. Eles são usados individualmente para enxaguar ferramentas de laboratório e vidros antes de usar. Uma mistura de diclorometano (DCM) ao metanol (MeOH; 9:1) é usada em muitos laboratórios para extrair biomarcadores eficientemente com uma ampla gama de polaridades. Os solventes devem estar livres de contaminantes orgânicos.
  4. Use um banho de água de sônica em temperatura ambiente. Uma gama de tamanhos de sonicator e sonicação com ou sem calor estão disponíveis nos principais varejistas de equipamentos científicos.
  5. Os frascos de frascos, que devem ser impermeáveis, serão colocados em banho de sônica.
  6. Capa química aprovada por solvente.

2. Preparação da Amostra

  1. Coloque uma lata de pesagem queimada na escala do laboratório e depois na piche.
  2. Enxágüe a espátula de laboratório com solvente, em seguida, use-a para transferir uma massa apropriada de amostra para a lata de pesagem, e regissão a massa.
    1. A massa da amostra varia dependendo do seu teor de matéria orgânica. Material magro de matéria relativamente orgânica (lama marinha) pode exigir vários gramas, enquanto material rico em matéria orgânica (tecido de folha) pode exigir muito menos.
  3. Transfira todo o material na lata de pesagem em um frasco queimado, pré-pesado e rotulado. Tampe o frasco e descarte a lata de pesagem.
  4. Realizar etapas 2.1 - 2.3 para cada amostra a ser extraída.

3. Extração

  1. Usando uma pipeta e uma lâmpada pré-combustão, transfira ~20 mL da mistura DCM:MeOH (9:1) em cada frasco (frasco deve estar aproximadamente meio cheio). Recapitulando frascos antes de passar para a próxima amostra, para que os solventes voláteis não evaporem.
    1. As volatilidades do DCM e do MeOH são diferentes. A evaporação do solvente de extração devido a frascos de amostra não tampados tem a capacidade de mudar sua polaridade e, portanto, a extração.
  2. Coloque os frascos de amostra em um rack de frasco impermeável.
  3. Verifique se o nível de água no banho de sônica é apenas profundo o suficiente para submergir os frascos de amostra até o topo do solvente de extração. Muita água pode fazer com que os frascos flutuem; muito pouca água pode impedir que as amostras sejam devidamente agitadas.
  4. Coloque o frasco com as amostras nele diretamente no banho de sônicação.
  5. Sonicato por 30 minutos em temperatura ambiente.
  6. Remova o rack de amostra do sonicator. Se extrair sedimentos, deixe-o definido por 30 minutos para permitir que a acomodação ocorra. Se extrair outro conjunto de amostras, coloque em sonicator neste momento.
  7. Remova a mistura DCM:MeOH do frasco de extração, usando uma pipeta e uma lâmpada pré-queimadas, e insira em outro frasco pré-pesado, pré-queimado e rotulado de 40 mL.
  8. Repita 3.1 - 3,7 3x para todas as amostras.
  9. Deixe as amostras extraídas secarem em seus frascos, tampas fora, e no capô, cobertos livremente com um pedaço de papel alumínio. Rotular como 'resíduo extraído' e armazenar.
  10. Rotule os extratos combinados para cada amostra como 'TLE'.

O primeiro passo na paleoclimatologia é coletar, ou extrair, os biomarcadores do sedimento em que são encontrados. As amostras ambientais são compostas de componentes não orgânicos, como minerais, água e metais, e componentes orgânicos que são criados por organismos vivos na área. Antes que esses componentes orgânicos possam ser usados pelos cientistas para elucidar informações sobre o passado, eles devem ser removidos de seu ambiente. A sonicação, que utiliza ondas ultrassônicas, é a mais simples e menos cara dessas técnicas.

Este vídeo faz parte de uma série sobre extração lipídica, purificação e análise de sedimentos. Ilustrará a extração lipídica por ultrassom e apresentará algumas aplicações do método.

Devido à ampla gama de biomarcadores, não há um único solvente otimizado para extrair todos eles. Isso é resumido pela regra chamada "como dissolve como as", pela qual moléculas relativamente apolares se dissolvem em solventes apolares, como o diclorometano, e mais moléculas polares se dissolvem em solventes mais polares, como o metanol. Misturas de solventes para a extração de lipídios específicos ou grupos de lipídios são geralmente otimizadas empiricamente.

Para acelerar a extração e aumentar o rendimento, um sistema de sônica é usado para aplicar ultrassom - ondas com frequências superiores a 20 kHz, em conjunto com a mistura de solventes. Quando essas ondas entram em contato com a fase orgânica líquida, causam a formação de microbolhas de curta duração de vapores solventes que crescem rapidamente e entram em colapso. Em colapso, essas bolhas liberam uma enorme quantidade de energia como tesoura mecânica, facilitando a solubilização lipídica e aumentando drasticamente a eficiência da extração.

Após o processo de extração assistida por solventes, o resultado é uma preparação de extrato bruto, chamada extrato lipídudo total, que é submetida a uma purificação adicional para permitir o exame qualitativo e quantitativo de assinaturas lipídicas. Agora que você entende alguns dos principais princípios por trás da extração lipídica por sônica, vamos dar uma olhada em um protocolo de como o procedimento é realizado.

Colete os materiais amostrais necessários a partir de um local escolhido. Alguns exemplos são lacotrinas e sedimentos marinhos, solos terrestres, culturas microbianas ou folhas de plantas. O material coletado é congelado durante a noite. Depois disso, é congelado em uma secadora congelante por 2 a 3 dias. Esmague e homogeneize as amostras congeladas antes da extração com argamassa e pilão de solvente. Para remover contaminantes orgânicos, combustão as pipetas de vidro borossilicatas necessárias, frascos e latas de pesagem em um forno. Depois de permitir que o vidro esfrie no forno, enxágue as ferramentas metálicas com uma mistura de diclorometano e metanol. Uma vez que a amostra e os vidros são preparados, o procedimento de sônica pode começar.

A partir deste passo, todos os recipientes e vidros devem ser queimados antes de serem usados. Coloque a lata de pesagem em uma balança e tare. Enxágüe a espátula de laboratório com a mistura de solventes, então, use-a para transferir uma massa apropriada de amostra congelada e homogeneizada para a lata de pesagem e registe a massa. Transfira cuidadosamente a amostra pesada para um frasco rotulado. Usando a garrafa de esguicho de DCM:MeOH, adicione o suficiente para que a amostra esteja coberta por 1 a 2 cm de solvente e tampa o frasco. Coloque o frasco em um rack impermeável, agora pronto para a sônicação. Coloque o rack diretamente no banho de sônica. Verifique se o nível de água no banho de sônica é apenas profundo o suficiente para submergir os frascos de amostra até o topo do solvente de extração. Sonicate por 30 minutos em temperatura ambiente. Após a sônicação, remova o rack do sonicator. Deixe os frascos sentarem-se para permitir que a fixação de sedimentos ocorra.

Remova a fase superior de diclorometano-metanol do frasco de extração usando uma pipeta e lâmpada, e transfira para outro frasco pré-pesado e rotulado. Repita o processo de sônica um total de três vezes para cada amostra. Colete os extratos em um frasco. Deixe as amostras extraídas secarem em seus frascos, tampas fora, e no capô, cobertos livremente com um pedaço de papel alumínio. Rotular como 'resíduo extraído' e armazenar no solvente de extração. Agora que os biomarcadores foram extraídos, eles devem ser purificados antes que a análise possa ocorrer.

A sônica acelera vários processos de extração de solventes e é amplamente utilizada em estudos geoquímicos. Muitos arqueólogos trabalham com geoquímicos para reconstruir as circunstâncias ambientais e culturais sob as quais as civilizações humanas primitivas viviam. A cerâmica, uma das mais antigas invenções humanas, quando desenterrada, pode ser encontrada para conter fósseis moleculares residuais de vinho, arroz ou outros conteúdos que já foram armazenados dentro.

Para desenterrar evidências químicas de substâncias absorvidas nas superfícies, pequenas amostras de cerâmica são sônicas na presença de solventes orgânicos e compostos extraídos podem ser posteriormente identificados rio abaixo por métodos espectroscópicos. Esse tipo de análise ajuda os arqueólogos a detectar os tipos de recursos disponíveis para populações antigas e reconstruir as condições de seu habitat.

Microalgas fotossintéticas são encontradas em ecossistemas marinhos e de água doce. Como crescem na mídia baseada em água do mar e sua cultura ocupa áreas significativamente menores, eles agora estão sendo amplamente estudados como uma alternativa promissora às plantas terrestres para a produção de biocombustíveis.

Para extrair lipídios de uma biomassa microálgica, esses pesquisadores descrevem uma extração de solvente assistida por sônica. A cavitação acústica durante a sônica efetivamente interrompe paredes de células microánguas rígidas, a fim de liberar lipídios. Tais técnicas auxiliam na caracterização de novas microalgas do meio ambiente para a produção de fontes de energia não petrolíferas.

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Results

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No final da extração, é evidente um extrato lipídeto total (TLE) para cada amostra. Cada frasco contém a matéria orgânica extraível de um sedimento, solo ou tecido vegetal. Estes TLEs agora podem ser analisados e seus componentes químicos identificados e quantificados.

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Applications and Summary

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Diferentes classes de biomarcadores transmitem informações sobre aspectos específicos do sistema terrestre. Por exemplo, em sua infância, a geoquímica orgânica estava principalmente preocupada com a formação, migração e alteração do petróleo, e muitas das ferramentas químicas que os geoquímicos orgânicos usam hoje são baseadas nessas investigações iniciais. Foi através da investigação de uma classe de compostos chamados isoperóides, tendo um padrão de carbono repetitivo (Figura 2), que os cientistas descobriram que o petróleo era composto pelos restos quimicamente alterados de antigos produtores primários, como plâncton no oceano (conversão em petróleo, Figura 3) ou pântanos de turfa em terra (carvão, Figura 4). Químicos de grandes companhias petrolíferas usaram as proporções de uma variedade de compostos, cada um com sua própria taxa de alteração conhecida, para estimar a idade do petróleo, de onde veio, e se valia a pena explorar. Hoje, novos biomarcadores estão sendo descobertos, identificados e caracterizados em amostras modernas e antigas analisadas em laboratórios de geoquímica orgânica em todo o mundo. Muitas das aplicações atuais buscam extrair informações ambientais de biomarcadores obtidos em amostras modernas (folhas, solo, micróbios, amostras de água, etc.) a fim de estender a utilidade do biomarcador a sedimentos antigos, em um esforço para reconstruir os climas, ambientes e ecossistemas do passado. Por exemplo, a distribuição de um grupo de biomarcadores chamados glicerol-dialkyl-tetraethers (GDGTs para abreviar), produzidos por uma suíte de arqueias e bactérias, foram encontrados em sedimentos modernos para mudar de forma previsível em resposta à temperatura do ar ou da água. Portanto, a distribuição desses biomarcadores em sedimentos antigos pode ser usada, ou através de uma série de sedimentos da idade conhecida, para reconstruir a temperatura do ar e da água de vários milhões de anos.

Figure 2
Figura 2. Isoprene compreende cinco átomos de carbono e duas ligações duplas. Quando somados na reação da biossíntese, podem formar moléculas complexas de diagnóstico para a presença de vida. Por exemplo, 2, 6,10,15,19-pentamethyleicosane, comumente encontrada em tapetes cianobacterianos.

Figure 3
Figura 3. Iluminação de plâncton nas Maldivas. Foto de Pawelg de direitos autorais.

Figure 4
Figura 4. Turfa de turfa a 4.500 metros de altitude nos Andes equatorianos. Direitos autorais Dr. Morley Read

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Transcript

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