Overview
Fonte: Laboratórios do Dr. Ian Pepper e Dr. Charles Gerba - Universidade do Arizona
Autora de Demonstração: Luisa Ikner
As bactérias estão entre as formas de vida mais abundantes na Terra. Eles são encontrados em todos os ecossistemas e são vitais para a vida cotidiana. Por exemplo, as bactérias afetam o que as pessoas comem, bebem e respiram, e na verdade há mais células bacterianas dentro do corpo de uma pessoa do que células de mamíferos. Devido à importância das bactérias, é preferível estudar determinadas espécies de bactérias em laboratório. Para isso, as bactérias são cultivadas sob condições controladas em cultura pura, o que significa que apenas um tipo de bactéria está em consideração. As bactérias crescem rapidamente na cultura pura, e o número de células aumenta drasticamente em um curto período de tempo. Medindo a taxa de aumento da população celular ao longo do tempo, uma "curva de crescimento" a ser desenvolvida. Isso é importante quando se pretende utilizar ou vacinar números conhecidos do isolado bacteriano, por exemplo, para melhorar o crescimento das plantas, aumentar a biodegradação de orgânicos tóxicos, ou produzir antibióticos ou outros produtos naturais em escala industrial.
Principles
A reprodução bacteriana ocorre por meio de fissão binária, na qual uma célula bacteriana se divide e se torna duas células(Figura 1). O tempo necessário para a divisão celular é conhecido como o tempo médio de geração, ou o tempo de duplicação, que é o tempo necessário para o número de células dobrar.
Figura 1. Divisão celular exponencial. Cada divisão celular resulta em uma duplicação do número da célula. Em números de células baixas, o aumento não é muito grande; no entanto, após algumas gerações, o número de células aumenta explosivamente. Depois das divisões, há células 2n.
Para entender e definir o crescimento de microrganismos particulares, eles são colocados em um frasco, onde o fornecimento de nutrientes e as condições ambientais são controlados. Se o meio líquido fornece todos os nutrientes necessários para o crescimento e parâmetros ambientais propícios ao crescimento, o aumento do número pode ser medido em função do tempo para obter uma curva de crescimento. Várias fases distintas de crescimento podem ser observadas dentro de uma curva de crescimento(Figura 2). Estes incluem a fase de defasagem, a fase exponencial ou de registro, a fase estacionária e a fase de morte, cada uma delas associada a alterações fisiológicas específicas(Tabela 1).
| Fase | Características | ||
| Fase de lag | Crescimento lento ou falta de crescimento devido à adaptação fisiológica das células às condições culturais ou diluição de exoenzymes devido às densidades celulares baixas iniciais. | ||
| Fase exponencial ou de registro | Taxas de crescimento ideais, durante as quais os números de células dobram em intervalos de tempo discretos conhecidos como tempo médio de geração. | ||
| Fase estacionária | O crescimento (divisão celular) e a morte das células se contrabalam, resultando em nenhum aumento líquido no número de células. A redução da taxa de crescimento é geralmente devido à falta de nutrientes e/ou ao acúmulo de constituintes de resíduos tóxicos. | ||
| Fase da Morte | A taxa de mortalidade excede a taxa de crescimento, resultando em perda líquida de células viáveis. | ||
Mesa 1. As quatro fases do crescimento bacteriano.
Figura 2. Uma curva típica de crescimento para uma população bacteriana. Compare a forma das curvas com base em unidades formadoras de colônias (UFC) versus densidade óptica, particularmente na fase de morte. A diferença se deve ao fato de que as células mortas ainda resultam em turbidez, mas não podem formar colônias viáveis na cultura.
No geral, muitas vezes é fundamental determinar a cinética de crescimento bacteriano para um determinado isolado bacteriano, a fim de saber o número de células bacterianas presentes no meio líquido. Existem diferentes maneiras de medir o crescimento em um meio líquido, incluindo medidas de turbidez usando um espectotômetro colorimétrico e revestimento de diluição serial. As medidas de turbidez dependem do fato de que quanto mais células presentes no meio líquido, mais turvo o líquido se torna. O revestimento de diluição serial envolve o ensaio do número de células no meio líquido que podem formar colônias viáveis sobre cultura sólida, uma medida conhecida como "unidades formadoras de colônias" da cultura. Note- se, no entanto, que tais ensaios de revestimento só podem ser usados para bactérias que são, de fato, culturable.
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Procedure
1. Coleção de Alíquotas de Cultura Bacteriana
- Um dia antes da coleta de pontos de tempo de crescimento, inocular 20 mL de caldo de soja tripática (TSB) médio em um frasco de 50 mL com E. coli.
- Incubar durante a noite a 27 °C. Este período de incubação relativamente longo resulta em uma população de fase estacionária de tipo selvagem E. coli de aproximadamente 1099 CFU/mL.
- No dia seguinte, use 100 μL da cultura preparada para inocular 250 mL de TSB (em um frasco de 500 mL). Homogeneizar. Remova uma alíquota de 5 mL e leve à geladeira imediatamente a 4 °C. Este é t = 0 ou T0 ponto de tempo, e deve conter aproximadamente 4 x 105 CFU/mL.
- Coloque o frasco do E. coli restante (245 mL) em uma incubadora de agitação de 37 °C. Remova alíquotas de cultura de 5 mL a cada hora, até 8h. Armazene cada alíquota a 4 °C. Designe essas alíquotas T1 a T8.
2. Diluição seriada
- Remova as alíquotas de E. coli da geladeira e coloque no gelo para o transporte. Mantenha todas as culturas no gelo até o uso.
- Configure uma série de tubos de diluição para obter várias diluições de cada cultura E. coli (Figura 3). Tubos de microfuge são convenientes para esta função. Cada tubo de diluição deve ter 900 μL de fluido de diluição (soro fisiológico estéril). Uma série de diluição é necessária para cada cultura E. coli (T0 a T8); rotular cada tubo de acordo com a Tabela 2.
Figura 3. Esquema mostrando o procedimento para chapeamento E. coli. - Inicie as diluições adicionando 100 μL de E. coli do tubo rotulado T0 (a cultura inicial E. coli) ao tubo A, que é a diluição de10 -1 de T0. Vórtice o tubo para 5 s.
- Posteriormente, adicione 100 μL de tubo A ao próximo tubo de soro fisiológico, tubo B, que é a diluição de 10-2 de T0. Continue a série de diluição necessária para cada alíquota de ponto de tempo. Lembre-se de vórtice de cada tubo antes da transferência. Também é importante usar uma nova dica de pipeta para cada transferência.
| Cultura E. coli | Diluições necessárias e tubo # | ||||||
| Um | B | C | D | E | F | G | |
| T0 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T1 | 10-1 | 10-2 | |||||
| T2 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | ||||
| T3 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | |||
| T4 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | ||
| T5 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T6 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T7 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
| T8 | 10-1 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 | 10-6 | |
Mesa 2. Série de diluição necessária para cada cultura E. coli.
3. Chapeamento
- Três diluições para cada alíquota de ponto de cultura E. coli serão emplacados, de acordo com a Tabela 3. Placas de etiqueta com o ponto de tempo (T1 a T8), o fator de diluição e volume a ser adicionado. Use placas triplicadas para cada diluição.
- Adicione 100 μL de cada diluição à placa, canalizar a quantidade para o centro da placa deágar (Figura 3). Espalhe imediatamente a alíquota utilizando uma haste de vidro em forma de "L" esterilizada por uma chama. Se a alíquota não for espalhada imediatamente, ela se torna in situ na placa, resultando em crescimento excessivo bacteriano no local da inoculação inicial.
- Repita o revestimento para cada série de diluição para os pontos de tempo T1 a T8. Lembre-se de esterilizar a haste entre as placas e especialmente entre diferentes diluições.
- Uma vez que as placas tenham secado por alguns minutos, inverta e coloque em incubadora de 37 °C durante a noite. Inverter as placas impede a condensação de cair sobre a placa de ágar. Após a incubação durante a noite, as placas devem ser armazenadas na geladeira.
| Cultura E.coli | Diluições a serem emplacados | ||
| T0 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T1 | 10-1 | 10-2 | 10-3 |
| T2 | 10-2 | 10-3 | 10-4 |
| T3 | 10-3 | 10-4 | 10-5 |
| T4 | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
| T5 | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T6 | 10-6 | 10-7 | 10-8 |
| T7* | 10-5 | 10-6 | 10-7 |
| T8* | 10-4 | 10-5 | 10-6 |
* Diluições mais baixas levam em conta populações mais baixas devido à fase de morte.
Mesa 3. Protocolo de chapeamento para culturas E. coli.
4. Contando colônias e calculando o tempo médio de geração
- Examine as placas para uniformidade das colônias e falta de contaminação.
- Para cada ponto de tempo (T0 a T8),escolha uma diluição que contenha entre 30 e 300 colônias, e conde placas triplicadas.
- Utilizando o fator de diluição, calcule de volta o número de células por mL de cultura original nos pontos de tempo T0 a T8. Por exemplo, se o número de colônias resultantes de uma diluição de 10-4 for 30, 28 e 32:
Número médio de colônias = 30 colônias
Estes surgiram de 0,1 mL de uma diluição de 10-4
Número de colônias por mL = 30 x 104 = 3 x 106 - Registro deparcela 10 CFU/mL versus tempo (em horas).
- A partir do gráfico, identifique a fase exponencial do crescimento. Usando 2 pontos de tempo dentro da fase de crescimento exponencial e os números de células correspondentes em cada momento, calcule o tempo médio de geração.
Medir a taxa de crescimento das bactérias é uma técnica microbiológica fundamental, e tem uso generalizado em pesquisas básicas, bem como em aplicações agrícolas e industriais.
As bactérias estão entre as formas de vida mais abundantes na Terra, estando presentes em todos os ecossistemas, incluindo o corpo humano. Certas espécies bacterianas também são geneticamente altamente tratáveis, e foram aproveitadas como modelos de pesquisa ou para produzir produtos naturais ou sintéticos em escala industrial. No entanto, nem todas as espécies bacterianas podem ser cultivadas em laboratório. Para quem pode, uma característica importante é a taxa de multiplicação, ou "cinética de crescimento".
Medir a taxa de crescimento de uma cultura bacteriana pode informar os cientistas sobre suas funções fisiológicas e metabólicas, e também é útil para obter um número celular preciso das bactérias para aplicações a jusante.
Este vídeo introduzirá os princípios por trás da análise da taxa de crescimento bacteriana, demonstrará um protocolo para caracterizar a taxa de crescimento com uma "curva de crescimento", e, finalmente, explorará várias aplicações científicas ambientais para medir cinética de crescimento bacteriano.
As bactérias geralmente se reproduzem assexuadamente, multiplicando-se por simples fissão binária onde uma célula parental se divide em duas células filhas idênticas. Em condições favoráveis de crescimento, onde os nutrientes estão disponíveis em abundância e parâmetros ambientais, como a temperatura, todos são propícios ao crescimento, a taxa de multiplicação excede em muito a taxa de mortalidade. Isso resulta em crescimento exponencial.
Medindo a quantidade de bactérias em uma cultura em função do tempo, uma curva de crescimento pode ser obtida. O crescimento de bactérias em uma cultura líquida em condições ideais produz uma curva de crescimento com uma forma característica que pode ser dividida em várias fases. A curva começa com uma "fase de defasagem", quando o crescimento é lento enquanto as bactérias se aclimatam às condições culturais. Em seguida, o "log" ou "fase exponencial", quando as bactérias experimentam crescimento exponencial. O crescimento eventualmente para quando os nutrientes se esgotam e os resíduos se acumulam, resultando em uma "fase estacionária". Finalmente, uma vez que a taxa de multiplicação é ultrapassada pela taxa de morte celular, a cultura entra na "fase da morte".
Para construir uma curva de crescimento, os números bacterianos em um frasco de cultura líquida são contados em diferentes pontos de tempo durante um determinado período de cultivo. As contagens bacterianas podem ser obtidas por vários métodos diferentes. Uma abordagem comum é medir a densidade óptica - ou "OD" - 600, que é a absorvância de luz da solução bacteriana a um comprimento de onda de 600 nm.
Outro método é determinar a "UFC", ou unidades formadoras de colônias, por mililitro da cultura. Devido à natureza clonal do crescimento bacteriano, uma bactéria em uma cultura pode teoricamente expandir-se para uma colônia observável em uma placa de ágar. Ao emplacar uma série de diluições de uma cultura bacteriana para alcançar uma concentração bacteriana onde colônias individuais e discretas podem ser observadas, um método chamado "revestimento de diluição serial", a contagem de colônias pode ser usada para calcular a concentração bacteriana em termos de UFC por mL.
Agora que você entende como o crescimento bacteriano pode ser analisado, vamos passar por um protocolo para realizar a análise da curva de crescimento sobre culturas puras de um modelo bacteriano bem estabelecido, Escherichia coli,usando o método de revestimento de diluição serial.
Um dia antes da coleta de ponto de tempo, inocular 20 mL de caldo de soja tripca pré-esterilizado, ou TSB, médio em um frasco de 50 mL com uma única colônia de E. coli.
Incubar a cultura durante a noite a 37 °C com agitação. Para E. coli,isso resultaria em uma população de fase estacionária de aproximadamente 1099 UFC/mL.
No dia seguinte, inocular 100 μL da cultura durante a noite em 250 mL de TSB em um frasco de 500 mL. Homogeneizar. Isso produz uma cultura diluída de aproximadamente 4 x 105 UFC/mL. Armazene 5 mL dessa cultura diluída em um tubo de cultura. Este é o alíquota do ponto 0, ou T0. Leve à geladeira imediatamente a 4 °C.
Incubar o volume restante da cultura a 37 °C com agitação. A cada hora depois, por até 8h, recolham alíquotas de 5 mL da cultura. Designe estas amostras T1 a T8, e armazene todas elas a 4 °C até usar.
No dia do experimento, remova as alíquotas do ponto de tempo E. coli da geladeira e mantenha-as no gelo. Use tubos de microfuge estéreis, cada um com 900 μL de soro fisiológico estéril, para configurar uma série de diluição para cada alíquota de acordo com a tabela a seguir.
Misture bem a cultura T0 com vórtice suavemente, depois adicione 100 μL ao tubo A de sua série de diluição, fazendo uma diluição de 1 em 10, ou 10-1. Tubo de Vórtice A para misturar, e usando uma ponta de pipeta fresca, adicione 100 μL de tubo A ao tubo B, fazendo a diluição de 1 em 100, ou 10-2.
Repita o processo para cada alíquota de cultura e faça a série de diluição apropriada de acordo com a Tabela 2. Uma vez que a série de diluição para todos os pontos de tempo foram feitas amostras, tem o número apropriado de placas de ágar de soja estéril de trippticase preparadas para revestimento bacteriano.
3 diluições de cada ponto de tempo cultura será banhada em triplicado de acordo com a tabela a seguir. Rotule as placas de acordo. Em seguida, pipeta 100 μL de cada cultura adequadamente diluída no centro da respectiva placa de ágar. Esterilizar uma haste de vidro em forma de "L", esfriar tocando a haste para o ágar longe do ânóculo, e imediatamente espalhar o líquido sobre a superfície do ágar. Por favor, note que um atraso na propagação pode resultar em crescimento excessivo bacteriano no local da inoculação.
Continue emplacando cada série de diluição para todas as 9 culturas de ponto de tempo, esterilizando a haste de espalhamento de vidro entre cada série de diluição.
Uma vez que as placas tenham sido permitidas a secar por alguns minutos, inverta e coloque-as na incubadora de 37 °C durante a noite. Após este período de crescimento, as placas podem ser armazenadas a 4 °C.
Após a incubação durante a noite das placas de diluição, examine-as para contaminação e uniformidade das colônias. Para cada cultura de ponto de tempo, escolha uma diluição para a qual há entre 30-300 colônias por placa. Conte o número de colônias em cada uma das placas triplicadas para essa diluição.
Utilizando o número médio de colônias para cada diluição e o fator de diluição, calcule a concentração de bactérias na cultura original em cada ponto de tempo da UFC/mL. Por exemplo, se houver, em média, 30 colônias do conjunto de placas triplicadas obtidas de 0,1 mL dos 10-4, ou 1 em 10.000, diluição, então haveria 30 divididos por 0,1 mL multiplicados por 10.000, ou 3 milhões de UFC/mL.
Utilizando a concentração bacteriana calculada para cada ponto de tempo, plote um gráfico do registro base-10 das concentrações bacterianas, na UFC/mL, contra o tempo em horas. A partir do gráfico, identifique a fase de registro do crescimento da cultura bacteriana original e escolha dois dos pontos de tempo dentro da fase de registro, designando o primeiro desses pontos de tempo como t = 0. Calcular o tempo médio de geração usando a equação X é igual a 2 ao poder de n multiplicado por X0 onde X é a concentração bacteriana no tempo t, X0 é a concentração inicial em t = 0, e n é o número de gerações que se passou entre os dois pontos de tempo.
Por exemplo, suponha que X0 seja de 1.000 UFC/mL, e em t = 6 h, a concentração é de 16.000 UFC/mL. Utilizando a equação, obtemos que 4 gerações ocorreram dentro de 6h, o que dá um tempo de geração de 6 dividido por 4 ou 1,5 h por geração.
A medição da cinética do crescimento bacteriano é fundamental para muitas aplicações para fins de pesquisa, agricultura ou bioengenharia.
Um uso para conhecer a taxa de crescimento bacteriano é permitir que uma quantidade precisa de uma cultura bacteriana seja obtida para inocular outra cultura ou meio. Por exemplo, certas culturas, como leguminosas, precisam ser cultivadas com bactérias simbióticas conhecidas como rizobia que colonizam as raízes das plantas para formar nódulos e "fixar" nitrogênio - convertendo nitrogênio atmosférico em amônia que pode ser utilizado pela planta. Para aplicações agrícolas, uma quantidade conhecida de rizobia é adicionada a um meio de carbono à base de turfa, que é então usado para vacinar sementes de leguminosas para estabelecer a simbiose vegetal-bacteriana.
A análise de crescimento também pode ser usada para identificar espécies bacterianas que podem degradar resíduos industriais e possivelmente gerar subprodutos valiosos. Neste exemplo, os pesquisadores investigaram como a mídia de crescimento complementada com licor negro, um produto de resíduos da produção de celulose de madeira e papel, afetou o crescimento de um isolado microbiano ambiental.
As bactérias não só demonstraram crescimento aprimorado com licor preto, mas também mostraram um padrão de crescimento "dipásico", indicando a presença de mais de uma fonte de carbono em licor preto que as bactérias podem metabolizar. Componentes individuais do licor negro poderiam então ser extraídos para análise de crescimento mais detalhada.
Finalmente, as medidas de taxa de crescimento também são úteis para caracterizar bactérias que foram projetadas para fins industriais específicos, por exemplo, para a remediação da poluição por óleo. Aqui, os cientistas criaram cepas bacterianas geneticamente modificadas que contêm enzimas para degradar os componentes de hidrocarbonetos do petróleo. A análise de crescimento foi realizada, por exemplo, para verificar se as bactérias projetadas aumentaram a taxa de crescimento do que as bactérias normais na presença dos hidrocarbonetos tóxicos, indicando uma melhor tolerância que permitirá que as bactérias projetadas realizem sua função de limpeza da poluição.
Você acabou de assistir ao vídeo da JoVE sobre a análise das taxas de crescimento bacteriana com curvas de crescimento. Agora você deve entender as diferentes fases de crescimento das culturas bacterianas, como realizar um experimento para obter uma curva de crescimento usando a coleta de ponto de tempo e o revestimento de diluição serial, e como a análise de crescimento pode ser aplicada a pesquisas e propósitos industriais. Como sempre, obrigado por assistir!
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Results
Após um experimento de revestimento de diluição serial, os seguintes dados foram obtidos. No início do crescimento exponencial designado aqui como tempo t = 0, a concentração inicial de células bacterianas é de 1.000 UFC/mL. No momento t = 6 h, a concentração de células é de 16.000 UFC/mL.
Agora, X = 2n x X0
Onde: X0 = concentração inicial de células = 1.000 UFC/mL
X = concentração de células após o tempo t = 16.000 UFC/mL
n = número de gerações
16.000 = 2n x 1.000
2n = 16
log10 2n = log10 16
n x 0,301 = 1.204
n = 1,204 = 4
0.301
Quatro gerações decorridos em 6 h, então
Tempo médio de geração = 6/4 = 1,5 h.
Figura 4. Um nódulo radicular que contém bactérias fixadoras de nitrogênio.
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Applications and Summary
O conhecimento da cinética de crescimento bacteriano e números bacterianos em um meio de cultura é importante tanto do ponto de vista da pesquisa quanto do ponto de vista comercial. Na pesquisa, muitas vezes é fundamental saber o número de bactérias em uma amostra, para que o experimento possa ser replicado, se necessário, com os mesmos números. Por exemplo, durante experimentos em que inoculantes bacterianos são adicionados a um lote de solo, um mínimo de10 4 UFC precisa ser adicionado por grama de solo para obter o efeito desejado, como a biodegradação aprimorada de contaminantes tóxicos do solo orgânico. Outro exemplo é o caso de inoculantes rizobiais produzidos comercialmente, onde números conhecidos de rizobia (bactérias que entram em relações simbióticas com as raízes das plantas) são impregnados em um meio de carbono à base de turfa(Figura 4). O meio é então usado para inocular sementes de leguminosas para melhorar a fixação biológica de nitrogênio (ou seja,a conversão de nitrogênio molecular em formas orgânicas que podem ser usadas por organismos como nutrientes).
A cinética de crescimento também é útil para avaliar se determinadas cepas de bactérias são adaptadas para metabolizar certos substratos, como resíduos industriais ou poluição por óleo. Bactérias geneticamente modificadas para limpar derramamentos de óleo, por exemplo, podem ser cultivadas na presença de hidrocarbonetos complexos para garantir que seu crescimento não seja reprimido pelos efeitos tóxicos do petróleo. Da mesma forma, a inclinação e a forma das curvas de crescimento produzidas a partir de bactérias cultivadas com misturas de resíduos industriais podem informar os cientistas se as bactérias podem metabolizar a substância específica, e quantas fontes potenciais de energia para as bactérias podem ser encontradas na mistura de resíduos.
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