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Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis)
 

Espectroscopia ultravioleta-visible (UV-Vis)

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Espectroscopia ultravioleta visible o UV-Vis, es uno de las más populares técnicas analíticas en el laboratorio.

En espectroscopía UV-Vis, la luz pasa a través de una muestra en una determinada longitud de onda en el ultravioleta o del espectro visible. Si la muestra absorbe parte de la luz, no toda la luz será pasar a través de, o transmitirse. Transmisión es el cociente de la intensidad de la luz transmitida a la luz del incidente y se relaciona a la absorbancia. La absorbancia puede utilizarse de una manera cuantitativa, para obtener la concentración de una muestra. También puede ser utilizado de una manera cualitativa, para identificar un compuesto combinando la absorbancia medida en un rango de longitudes de onda, llamado el espectro de absorbancia, a los datos publicados. Este video será introducir espectroscopía UV-Vis y demostrar su uso en el laboratorio en la determinación cinética de reacción y concentración de la muestra.

Cuando un fotón golpea una molécula y es absorbido, la molécula es promovida desde su estado en un estado de mayor energía. La diferencia de energía entre los dos es el boquete de la venda. La energía del fotón debe coincidir exactamente con el boquete de la venda en orden para el fotón sea absorbido. La estructura química determina el boquete de la venda; por lo tanto las moléculas cada tienen espectros de absorción único.

Absorbancia sigue la ley de Beer, que muestra los Estados es igual al coeficiente de atenuación molar veces la longitud de la ruta y la concentración. El coeficiente de atenuación molar está relacionada con la capacidad individual de los compuestos que absorben la luz de una longitud de onda específica. Longitud de la ruta se refiere a la distancia recorrida por la luz a través de la muestra, que normalmente es 1 cm para cubetas estándar. Ley de Beer se puede utilizar para calcular la concentración de la muestra, si la absortividad es conocida, o puede utilizar una curva de calibración.

UV-Vis se denomina una técnica general, como la mayoría de las moléculas absorbe la luz en el rango UV-visible de longitud de onda. La gama UV se extiende de 100 – 400 nm y las gamas del espectro visible de 400-700 nm. Sin embargo, espectrofotómetros más no operan en la gama ultravioleta profunda de 100 – 200 nm, como fuentes de luz en esta gama son caras. Espectrofotómetros UV-Vis la mayoría utilizan una lámpara de deuterio para la gama de UV, que produce luz de 170 – 375 nm y una lámpara de filamento de tungsteno para la gama visible, que produce luz de 350 – 2.500 nm.

Puesto que la fuente de luz es generalmente una lámpara con longitudes de onda amplia, la longitud de onda de absorbancia específica se selecciona mediante filtros o un monocromador. Un monocromador es un dispositivo que separa espacialmente las longitudes de onda de la luz y luego coloca una rendija de salida donde es la longitud de onda deseada de la luz. El monocromador puede analizarse en un rango de longitud de onda para proporcionar un espectro de absorbancia todo. Esto hace que la técnica útil para cuantificar e identificar una amplia gama de moléculas.

Ahora que han sido subrayados los fundamentos de la espectroscopía UV-Vis, permite echar un vistazo a un simple experimento de UV-Vis en el laboratorio.

Antes de comenzar la medición, encender el espectrofotómetro y permitir que las lámparas se caliente por un período adecuado de tiempo para estabilizarlos.

Preparar un espacio en blanco por llenar una cubeta limpia con el disolvente de la muestra y luego limpie el exterior con papel sin pelusa para quitar cualquier las huellas dactilares.

Asegúrese que la cubeta esté correctamente alineada con los lados acanalados de la ruta de la viga e inserte en el espectrofotómetro. Asegure la tapa para evitar que la luz ambiental en el sistema.

Medir la absorbancia del blanco en una longitud de onda, o en un rango de longitud de onda. Grabar o guardar la absorbancia, como debe ser restada de la absorbancia de la muestra.

A continuación, deseche el espacio en blanco y enjuagar la cubeta dos veces con la muestra. Luego, llene la cubeta aproximadamente 3/4 completo con muestra. Limpie el exterior de la cubeta, para que esté limpio y libre de huellas digitales.

Colocar la cubeta en el espectrofotómetro en la orientación correcta y la tapa.

Recoge una medida de absorbancia o espectro en la misma longitud de onda o longitud de onda como el espacio en blanco. Restar el espectro en blanco o la medición, si el instrumento no automáticamente lo hace.

Del espectro de absorbancia recogidos, determinar el máximo de absorbancia y λmax.

Para cuantificar la cantidad de analito en la muestra, cree una curva de calibración utilizando una gama de concentraciones conocidas de analito. Para más información sobre cómo construir y utilizar una curva de calibración, por favor ver el vídeo "curvas de calibración" de la colección.

La medida de absorbancia puede utilizarse también para calcular la cinética de la reacción midiendo el aumento o disminución de la concentración de compuestos a lo largo de la reacción. Comience tomando una lectura inicial de la muestra, azul tinte en este caso, en la absorbancia máxima antes de la reacción.

A continuación, rápidamente agregar el reactivo, bleach en este caso, para iniciar la reacción química. Removemos bien, para que se mezcla con la muestra.

Medir la absorbancia en el máximo de absorbancia en el tiempo.

Se muestra el espectro de absorbancia inicial de la muestra de colorante azul. Los colores de fondo muestran los colores de la luz en el espectro visible. El tinte azul tiene un máximo de absorbancia a unos 630 nm.

La cinética de la reacción entre el tinte azul y cloro se midió con el tiempo. La absorción de colorante azul disminuye con el tiempo, a medida que reacciona con el cloro. La absorbancia alcanza cerca de cero después de 300 s, indicando que la reacción ha casi completado. Para obtener más información sobre cinética y reacciones, por favor ver la enseñanza de las Ciencias JoVE video "leyes de tarifa de reacción".

Espectroscopía UV-Vis se utiliza pesadamente en muchas áreas de investigación para identificar o cuantificar una muestra.

Por ejemplo, espectroscopía UV-Vis se utiliza pesadamente en los campos biológicos para cuantificar la cantidad de proteína en una muestra. Un análisis de Bradford es a menudo utilizado para cuantificar proteínas, con la ayuda de un colorante. En primer lugar, se prepara una curva de calibración de concentraciones conocidas de proteína, normalmente utilizando albúmina sérica bovina, o BSA. Luego se añade colorante azul de Coomassie a cada uno de los estándares y la muestra. Luego se mide la absorbancia del complejo proteína-colorante a 595 nm.

Por otra parte, las proteínas pueden medirse directamente por su absorbancia a 280 nm. En este ejemplo, la concentración de proteína se cuantifica con un espectrofotómetro de ultra bajo volumen. Para muchas proteínas, una absorbancia de 1 corresponde a una concentración de 1 mg/mL.

Espectroscopía UV-Vis se utiliza también para cuantificar la cantidad de células bacterianas en un cultivo celular. Para esta medición, la absorbancia o densidad óptica se mide a 600 nm. Por lo general, una medición de OD600 de 1 indica la presencia de 8 x 108 células bacterianas por mL. Medición de la densidad celular durante el crecimiento de la cultura permite la determinación de la curva de crecimiento bacteriano y puede ayudar a identificar cuando una cultura está en su fase de crecimiento exponencial.

Óxido de nitrógeno y dióxido de nitrógeno o NOx, es un subproducto de escape de automóvil y puede ser perjudiciales para el medio ambiente porque es dañino el ozono troposférico. NOx se puede medir por la reacción con una solución de ácido sulfanílico y napthyl-etilendiamina. La solución resultante es una molécula de color de rosa coloreado tinte de azo, la intensidad de la que se correlaciona directamente a ninguna concentración dex . Esta concentración puede determinarse entonces usando un espectrofotómetro UV-Vis.

Sólo ha visto la introducción de Zeus a la espectroscopia UV-visible. Ahora debe comprender los conceptos básicos de operación de UV-Vis, cómo se mide una muestra usando un UV-Vis y cómo establecer una correlación entre la absorbancia a concentración de la muestra.

¡Gracias por ver!

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