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Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis)
 
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Espectroscopia ultravioleta-visível (UV-Vis)

Overview

Fonte: Laboratório da Dra.B. Jill Venton - Universidade da Virgínia

A espectroscopia ultravioleta visível (UV-Vis) é uma das técnicas analíticas mais populares porque é muito versátil e capaz de detectar quase todas as moléculas. Com espectroscopia UV-Vis, a luz UV-Vis é transmitida através de uma amostra e a transmissão da luz por uma amostra é medida. A partir da transmissão (T), a absorvância pode ser calculada como A=-log (T). Um espectro de absorvência é obtido que mostra a absorvência de um composto em diferentes comprimentos de onda. A quantidade de absorvância em qualquer comprimento de onda é devido à estrutura química da molécula.

UV-Vis pode ser usado de forma qualitativa, para identificar grupos funcionais ou confirmar a identidade de um composto, combinando com o espectro de absorvância. Também pode ser usado de forma quantitativa, pois a concentração do analito está relacionada à absorvância utilizando a Lei da Cerveja. A espectroscopia UV-Vis é usada para quantificar a quantidade de DNA ou proteína em uma amostra, para análise de água, e como detector para muitos tipos de cromatografia. Cinéticas de reações químicas também são medidas com espectroscopia UV-Vis, tomando repetidas medições UV-Vis ao longo do tempo. As medições UV-Vis são geralmente tomadas com um espectotômetro. UV-Vis também é um detector muito popular para outras técnicas analíticas, como a cromatografia, porque pode detectar muitos compostos.

Normalmente, UV-Vis não é a técnica de espectroscopia mais sensível, porque pouca luz é absorvida por um curto comprimento de caminho. Outras técnicas de espectroscopia, como a fluorescência, têm maior sensibilidade, mas não são tão geralmente aplicáveis, já que a maioria das moléculas não são fluorescentes. UV-Vis tem sensibilidade semelhante a outras medidas de absorção, como espectroscopia infravermelha.

Principles

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UV-Vis é frequentemente chamado de técnica geral porque a maioria das moléculas absorverá na faixa de comprimento de onda UV-Vis. O UV se estende de 100 a 400 nm e o espectro visível de 400-700 nm. A faixa de 100-200 nm é chamada de UV profundo. Fontes de luz são mais difíceis de encontrar para esta faixa, por isso não é usado rotineiramente para medições UV-Vis. Espectrômetros típicos de UV-Vis usam uma lâmpada deutério para o UV que produz luz de 170-375 nm e uma lâmpada de filamento de tungstênio para visível, que produz luz de 350-2.500 nm.

Quando um fóton atinge uma molécula e é absorvido, a molécula é promovida em um estado energético mais animado. A luz visível UV tem energia suficiente para promover elétrons para um estado eletrônico mais alto, desde o orbital molecular mais ocupado (HOMO) até o menor orbital molecular desocupado (LUMO). A diferença de energia entre o HOMO e o LUMO é chamada de lacuna de banda. Normalmente, esses orbitais são chamados de ligação e anti-ligação. A energia do fóton deve corresponder exatamente à lacuna de banda para que o fóton seja absorvido. Assim, moléculas com diferentes estruturas químicas têm diferentes lacunas de banda de energia e diferentes espectros de absorção. As transições mais comuns que caem na faixa UV-Vis são π-π* e n-π*. Os orbitais pi surgem devido a ligações duplas, e n orbitais são para elétrons não-ligados. A estrela Pi são orbitais pi anti-ligação. Assim, a melhor absorção UV-Vis é por moléculas que contêm ligações duplas. Orbitais pi adjacentes uns aos outros que estão conectados, chamados de conjugação, normalmente aumenta a absorção. As transições Sigma-σ*, associadas a ligações únicas, são de maior energia e caem no UV profundo, por isso são menos úteis para o uso rotineiro. O aparecimento de faixas largas ou ombros na estrutura UV-Vis é devido aos numerosos estados vibracionais e rotacionais de uma molécula, que levam a lacunas separadas de bandas de energia de energias ligeiramente diferentes.

Para moléculas com absorção na região visível, os compostos muitas vezes aparecem coloridos. No entanto, um equívoco comum é que o comprimento de onda da absorção de pico (λmax) para um composto é a cor que aparece. Um composto que aparece vermelho não tem muita absorção na região vermelha do espectro. Em vez disso, oλ max para um composto que parece vermelho é verde. A cor de um composto surge porque esses comprimentos de onda de luz são transmitidos seletivamente através da amostra, e assim eles não são absorvidos. Uma roda de cor é útil para determinar qual cor um composto absorverá e qual será o alcance do λmax, já que a cor diretamente através da roda da cor observada é a cor mais absorvida.

A absorção segue a Lei da Cerveja, A=εbC onde ε é o coeficiente de atenuação molar, b é comprimento do caminho, e C é concentração. O coeficiente de atenuação molar é a característica de um composto individual para absorver em um determinado comprimento de onda e esta propriedade é devido a grupos funcionais, conjugação, etc. Se um composto não tiver um alto coeficiente de atenuação,ele pode ser marcado com um grupo apropriado para aumentar sua absorção. O comprimento do caminho está geralmente relacionado com o tamanho do cuvette e é de 1 cm em espectrofotômetros padrão.

O UV-Vis é realizado em uma variedade de instrumentos, desde espectrofotômetros tradicionais até leitores de placas mais modernos. O comprimento de onda de absorção deve ser escolhido, seja usando um filtro ou um monocromador. Um monocromador é um dispositivo que separa os comprimentos de onda da luz espacialmente e, em seguida, coloca uma fenda de saída onde está o comprimento de onda desejado da luz. Monocromadores podem ser escaneados para fornecer todo um espectro de absorção. Alternativamente, um instrumento de matriz de diodo permite que todas as cores de luz sejam transmitidas através da amostra, em seguida, a luz é separada em diferentes comprimentos de onda espacialmente e detectada usando fotodiodos. Os instrumentos de matriz de diodo coletam espectros completos mais rápido, mas são mais complicados e mais caros.

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Procedure

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1. Calibrar o Espectrômetro

  1. Ligue o espectrômetro UV-Vis e deixe as lâmpadas aquecerem por um período de tempo apropriado (cerca de 20 minutos) para estabilizá-las.
  2. Encha uma cuvette com o solvente para a amostra e certifique-se de que o exterior está limpo. Isso servirá como um espaço em branco e ajudará a explicar as perdas leves devido à dispersão ou absorção pelo solvente.
  3. Coloque a cuvette no espectrômetro. Certifique-se de alinhar o cuvette corretamente, pois muitas vezes o cuvette tem dois lados, que são destinados ao manuseio (pode ser ranhurado) e não são feitos para brilhar luz através.
  4. Faça uma leitura para o branco. A absorvância deve ser mínima, mas qualquer absorvância deve ser subtraída de amostras futuras. Alguns instrumentos podem armazenar os dados em branco e realizar a subtração automaticamente.

2. Realize um espectro de absorção

  1. Encha o cuvette com a amostra. Para ter certeza de que a transferência é quantitativa, enxágue a cuvette duas vezes com a amostra e, em seguida, preencha-a cerca de 3/4 cheia. Certifique-se de que o exterior está limpo de quaisquer impressões digitais, etc.
  2. Coloque a cuvette no espectrômetro na direção correta.
  3. Cubra a cuvette para evitar qualquer luz ambiente.
  4. Colete um espectro de absorção permitindo que o instrumento escaneie através de diferentes comprimentos de onda e colete a absorvência. O intervalo de comprimento de onda pode ser definido com informações sobre a amostra específica, mas um intervalo de 200-800 nm é padrão. Um instrumento de matriz de diodo é capaz de coletar todo um espectro de absorção em uma única corrida.
  5. Do espectro de absorvância coletado, determine o máximo de absorvância (λmax). Repita a coleção de espectros para obter uma estimativa de erro noλ max.
  6. Para fazer uma curva de calibração, colete o espectro UV-Vis de uma variedade de diferentes amostras de concentração. Os espectrômetros são muitas vezes limitados em faixa linear e não serão capazes de medir um valor de absorção superior a 1,5. Se os valores de absorção da amostra estiverem fora da faixa linear do instrumento, dilui a amostra para obter os valores dentro da faixa linear.

3. Experimentos cinéticos com espectroscopia UV-Vis

  1. UV-Vis pode ser usado para experimentos cinéticos examinando a mudança de absorvência ao longo do tempo. Para um experimento cinético, faça uma leitura inicial da amostra.
  2. Adicione rapidamente o reagente para iniciar a reação química.
  3. Mexa bem para misturar com a amostra. Se uma pequena quantidade for adicionada, isso pode ser feito em um cuvette. Alternativamente, misture o reagente com a amostra e despeje rapidamente um pouco em uma cuvette para uma medição.
  4. Meça a absorvância nomáximo λ para o analito de interesse ao longo do tempo. Se usar o reagente sendo medido (ou seja, a absorvência está subindo porque há menos reagente para absorver), então a decomposição indicará a ordem da reação.
  5. Usando uma curva de calibração, faça um gráfico de concentração de analito versus tempo, convertendo o valor de absorção em concentração. A partir daí, este gráfico pode ser adequado com equações apropriadas para determinar as constantes da taxa de reação.

A espectroscopia ultravioleta, ou UV-Vis, é uma das técnicas analíticas mais populares em laboratório.

Na espectroscopia UV-Vis, a luz é transmitida através de uma amostra em um comprimento de onda específico no espectro UV ou visível. Se a amostra absorver parte da luz, nem toda a luz será transmitida, ou será transmitida. A transmissão é a razão da intensidade da luz transmitida à luz incidente, e está correlacionada com a absorção. A absorvância pode ser usada de forma quantitativa, para obter a concentração de uma amostra. Também pode ser usado de forma qualitativa, para identificar um composto, combinando a absorvância medida sobre uma gama de comprimentos de onda, chamado de espectro de absorvância, aos dados publicados. Este vídeo introduzirá espectroscopia UV-Vis, e demonstrará seu uso em laboratório na determinação da concentração da amostra e da cinética de reação.

Quando um fóton atinge uma molécula e é absorvido, a molécula é promovida de seu estado terrestre em um estado de maior energia. A diferença de energia entre os dois é a lacuna de banda. A energia do fóton deve corresponder exatamente à lacuna da banda para que o fóton seja absorvido. A estrutura química determina a lacuna da banda; portanto, moléculas cada uma tem espectros de absorção únicos.

A absorvância segue a Lei de Beer, que afirma que a absorvância é igual ao coeficiente de atenuação molar, vezes o comprimento e concentração do caminho. O coeficiente de atenuação molar está relacionado com a capacidade do composto individual de absorver a luz de um comprimento de onda específico. O comprimento do caminho refere-se à distância percorrida pela luz através da amostra, que normalmente é de 1 cm para cuvetas padrão. A lei da cerveja pode ser usada para calcular a concentração amostral, se a absortividade for conhecida, ou se uma curva de calibração pode ser usada.

UV-Vis é frequentemente chamado de técnica geral, pois a maioria das moléculas absorvem luz na faixa de comprimento de onda visível UV. A faixa UV se estende de 100 a 400 nm, e o espectro visível varia de 400 a 700 nm. No entanto, a maioria dos espectrofotômetros não operam na faixa UV profunda de 100-200 nm, já que as fontes de luz nesta faixa são caras. A maioria dos espectrofotômetros UV-Vis usam uma lâmpada deutério para a gama UV, que produz luz de 170 a 375 nm, e uma lâmpada de filamento de tungstênio para a gama visível, que produz luz de 350 a 2.500 nm.

Uma vez que a fonte de luz é geralmente uma lâmpada com amplas faixas de comprimento de onda, o comprimento de onda de absorção específico é selecionado usando filtros ou um monocromador. Um monocromador é um dispositivo que separa os comprimentos de onda da luz espacialmente, e então coloca uma fenda de saída onde está o comprimento de onda desejado da luz. O monocromador pode ser escaneado sobre uma faixa de comprimento de onda para fornecer todo um espectro de absorção. Isso torna a técnica útil para quantificar e identificar uma ampla gama de moléculas.

Agora que o básico da espectroscopia UV-Vis foi delineado, vamos dar uma olhada em um simples experimento UV-Vis em laboratório.

Antes de iniciar a medição, ligue o espectrômetro e deixe as lâmpadas aquecerem por um período de tempo apropriado para estabilizá-las.

Prepare um branco preenchendo uma cuvette limpa com o solvente de amostra e, em seguida, limpe o exterior com papel sem fiapos para remover quaisquer impressões digitais.

Certifique-se de que o cuvette esteja alinhado corretamente com quaisquer lados ranhurados fora do caminho do feixe e insira-o no espectrômetro. Fixar a tampa para evitar que a luz ambiente entre no sistema.

Meça a absorvência do vazio em um comprimento de onda, ou sobre uma faixa de comprimento de onda. Registre ou salve a absorvância, pois deve ser subtraída da absorvância da amostra.

Em seguida, descarte o branco e enxágue a cuvette duas vezes com a amostra. Em seguida, encha a cuvette cerca de 3/4 cheia com amostra. Limpe novamente o lado de fora da cuvette, para garantir que ele esteja limpo e livre de impressões digitais.

Coloque a cuvette no espectrômetro na orientação correta e fixe a tampa.

Colete uma medição de absorção ou espectro no mesmo comprimento de onda ou comprimento de onda que o em branco. Subtraia o espectro ou a medição em branco, se o instrumento não o fizer automaticamente.

Do espectro de absorvância coletado, determine o máximo de absorvância, ou λmax.

Para quantificar a quantidade de analito na amostra, crie uma curva de calibração usando uma gama de concentrações conhecidas de analito. Para obter mais informações sobre como construir e usar uma curva de calibração, assista ao vídeo desta coleção "Curvas de Calibração".

A medição de absorvência também pode ser usada para calcular cinética de reação medindo o aumento ou diminuição de uma concentração de compostos ao longo da reação. Comece fazendo uma leitura inicial da amostra, corante azul neste caso, no máximo de absorvância antes da reação.

Em seguida, adicione rapidamente o reagente, alvejante neste caso, para iniciar a reação química. Mexa bem, para que se misture com a amostra.

Meça a absorvência no máximo de absorvância ao longo do tempo.

O espectro inicial de absorção da amostra de corante azul é mostrado. As cores de fundo mostram as cores de luz no espectro visível. O corante azul tem um máximo de absorção de cerca de 630 nm.

A cinética da reação entre corante azul e alvejante foi medida ao longo do tempo. A absorção do corante azul diminui com o tempo, pois reage com o alvejante. A absorvência chega perto de zero após os anos 300, indicando que a reação se aproximava da conclusão. Para obter mais informações sobre cinéticas e reações, assista ao vídeo "Reaction Rate Laws" da JoVE Science Education.

A espectroscopia UV-Vis é usada fortemente em muitas áreas de pesquisa diferentes para identificar ou quantificar uma amostra.

Por exemplo, a espectroscopia UV-Vis é usada fortemente em campos biológicos para quantificar a quantidade de proteína em uma amostra. Um ensaio de Bradford é frequentemente usado para quantificar proteínas, com o auxílio de um corante. Primeiro, uma curva de calibração de concentrações de proteínas conhecidas é preparada, tipicamente usando Bovine Serum Albumin, ou BSA. Em seguida, a mancha azul coomassie é adicionada a cada um dos padrões e à amostra. A absorção do complexo de corantes proteicos é então medida a 595 nm.

Alternativamente, as proteínas podem ser medidas diretamente por sua absorvância a 280 nm. Neste exemplo, a concentração de proteínas é quantificada usando um espectotômetro de volume ultra baixo. Para muitas proteínas, uma absorvência de 1 se correlaciona com uma concentração de 1 mg/mL.

A espectroscopia UV-Vis também é usada para quantificar a quantidade de células bacterianas em uma cultura celular. Para esta medição, a absorvância, ou densidade óptica, é medida a 600 nm. Normalmente, uma medição de600 OD de 1 indica a presença de 8 x 108 células bacterianas por mL. Medir a densidade celular ao longo do crescimento cultural permite a determinação da curva de crescimento bacteriano, e pode ajudar a identificar quando uma cultura está em sua fase de crescimento exponencial.

Óxido de nitrogênio e dióxido de nitrogênio, ou NOx,é um subproduto do escapamento do automóvel, e pode ser prejudicial ao meio ambiente porque forma ozônio troposférico prejudicial. NOx pode ser medido reagindo-o com uma solução de ácido sulfanílico e napthyl-etilenodiamina. A solução resultante é uma molécula de corante azo cor-de-rosa, a intensidade da qual está diretamente correlacionada com a concentração NOx. Esta concentração pode então ser determinada usando um espectotômetro UV-Vis.

Você acabou de assistir a introdução de JoVE à espectroscopia visível UV. Agora você deve entender o básico da operação UV-Vis, como medir uma amostra usando um UV-Vis e como correlacionar a absorvência à concentração amostral.

Obrigado por assistir!

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Results

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UV-Vis pode ser usado para obter um espectro de compostos coloridos. Na Figura 1A,o espectro de absorvância de um corante azul é mostrado. O fundo mostra as cores de luz no espectro visível. O corante azul tem uma absorvânciamáxima λ no laranja/vermelho. A Figura 1B mostra um espectro de um corante vermelho, com λmax no verde.

Cinética pode ser medida a partir de um gráfico de absorvância em um comprimento de onda ao longo do tempo. A Figura 2 mostra um gráfico da absorção de um corante azul (a 630 nm) enquanto reage com alvejante.

Figure 1
Figura 1. Espectros de absorção UV-Vis. A. Corante azul #1 tem máxima absorção no laranja/vermelho. B. Corante vermelho #40 tem máxima absorvância no verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. UV-Vis para cinética. A absorção de corante azul #1 como ele reage com alvejante. A curva pode ser encaixada com uma decadência exponencial, indicando cinética de primeira ordem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Applications and Summary

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UV-Vis é usado em muitas análises químicas. É usado para quantificar a quantidade de proteína em uma solução, pois a maioria das proteínas absorve fortemente a 280 nm. A Figura 3 mostra um exemplo de espectro de citocromo C, que tem uma alta absorvância em 280 e também em 450 por causa de um grupo de heme. UV-Vis também é usado como uma técnica padrão para quantificar a quantidade de DNA em uma amostra, já que todas as bases absorvem fortemente a 260 nm. RNA e proteínas também absorvem a 260 nm, de modo que a absorção em outros comprimentos de onda pode ser medida para verificar se há interferências. Especificamente, as proteínas absorvem fortemente a 280 nm, de modo que a razão de absorvância em 280/260 pode dar uma medida da razão de proteína para DNA em uma amostra.

A maioria das análises simples mede a absorvência de um comprimento de onda de cada vez. No entanto, mais informações químicas estão presentes se as medições forem feitas em muitos comprimentos de onda simultaneamente. Instrumentos de matriz de diodo capturam toda a luz que é transmitida, dividem a luz em cores diferentes usando um prisma ou grade holográfica e, em seguida, a absorção em diferentes comprimentos de onda é capturada em uma matriz linear de fotodiodos. A vantagem deste método é que ele é útil para medir muitas moléculas diferentes simultaneamente.

Figure 3
Figura 3. Espectro UV-Vis de uma proteína. O pico de 280 nm é indicativo de uma proteína. O pico em 450 é devido à absorção do grupo heme no citocromo C.

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