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물 샘플에서 분변 박테리아 여과 분리
 
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물 샘플에서 분변 박테리아 여과 분리

Overview

출처: 이안 페퍼 박사와 찰스 게르바 박사의 연구소 - 애리조나 대학교
데모 저자: 루이사 이크너

농업, 레크리에이션 및 국내 환경에서 사용할 수 있는 물의 품질은 수인성 질병의 발병 가능성으로 인해 매우 중요합니다. 이러한 사건에 연루 된 미생물 에이전트는 기생충을 포함, 박테리아, 감염된 사람과 동물의 대변에서 높은 숫자에서 흘린 바이러스. 새롭고 취약한 호스트로 전송하는 것은 오염된 물의 섭취 시 배설물 구강 경로를 통해 발생할 수 있습니다. 따라서 병원성 미생물의 존재에 대한 수원을 모니터링하는 능력은 공중 보건을 보장하기 위해 중요합니다.

물과 가변 농도에 존재할 수 있는 잠재적인 배설구 병원균의 수가 다양하기 때문에, 정기적으로 그들 각각에 대해 직접 분석하는 것은 비현실적이고 비쌉니다. 따라서 수질 모니터링을 위한 미생물 분석은 대장균 표시기 박테리아를 채용합니다. 대장균은 부분적으로, 온혈 포유동물의 정상적인 장내 미생물을 구성하고, 비병원성이며, 대변에서 일관되게 배설된다. 따라서, 물에서 대장균 박테리아의 검출은 배설물이 발생하고, 유해한 병원성 미생물도 존재할 수 있음을 의미한다.

Principles

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막 여과 기술은 대변 표시기 박테리아에 대한 속아말하여 물의 미생물 품질을 평가하는 데 사용됩니다. 물의 양(예를들어, 100mL)은 0.45 μm의 최소 평균 기공 크기로 특수 멤브레인 필터를 통과하여 박테리아의 포획을 용이하게 하며, 크기는 약 1μm이다. 여과 후, 멤브레인은 전문 아가로즈 배양 배지에 신중하게 적용되고, 표적 미생물을 배양하는 데 적합한 조건하에서 배양된다.

수질 모니터링에 사용할 경우 멤브레인 여과는 식수, 수영장 및 호수 및 저수지와 같은 천연 레크리에이션 물과 같은 낮은 탁도 공급원에 가장 적합합니다. 미립자물질(예: 원시 하수)이 높은 물은 필터의 오염을 초래할 것이다. 따라서 더 작은부피(예: 100mL)만 분석할 수 있다. 멤브레인 여과는 또한 많은 수의 배경(또는 비대장균) 박테리아를 가진 수원에 실용적이지 않으며, 이는 인큐베이션 다음 아가로즈 배지상에서 표적 대장균 균을 열거하는 어려움을 증가시킬 수 있다.

이 비디오는 식수 및 환경 용수 샘플의 수집, 샘플의 막 여과, 총 대장균, 대변 대장균 및 대변 장퇴균을 포함한 전문 아가로즈 성장 매체를 사용하여 여러 유형의 배설물 지표 세균 식민지의 열거를 보여줍니다. 추정 식민지를 확인하기 위해 추가 수행 된 테스트도 표시됩니다.

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Procedure

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1. 물 샘플 수집 및 처리

  1. 시험수원(예: 분수, 수영장, 저수지, 물 분배 시스템, 원시 또는 처리된 하수)에서 1-L 수질 샘플을 수집하고 미생물 분석을 위해 얼음으로 운반합니다.
  2. 자동 분해, UV 방사선(2분) 또는 에탄올 화염 점화에 대한 노출에 의해 사용하기 전에 멤브레인 여과 매니폴드 어셈블리를 살균하거나 살균한다.
  3. 모든 부품을 냉각하면 진공 펌프와 표백제가 들어있는 진공 여과 폐기물 플라스크에 매니폴드를 적절하게 연결하십시오.
  4. 에탄올-화염은 한 쌍의 포셉을 살균하고 그들과 함께 포장에서 멸균된 격자 멤브레인 필터를 제거합니다. 직경 47mm의 직경은 0.45 μm 크기의 모공 크기가 전형적으로 사용됩니다. 그러나, 대체 직경 및 모공 크기는 모공 크기가 표적 미생물(들)을 충분히 함정에 빠뜨릴 수 있고, 필터 영역의 70% 이상이 모공 공간으로 구성된경우 사용될 수 있다.
  5. 필터를 매니폴드의 멤브레인 여과 영역의 중앙에 놓고 멸균 필터 깔때기를 장치에 적용하여 제자리에 고정시킵니다.
  6. 원하는 양의 테스트워터(예: 100mL)를 측정하고 깔때기에 추가합니다(깔때기에서 100mL 라인 마크가 표시됩니다).
  7. 필터를 통해 테스트 샘플을 그리기 위해 부분 진공 [34 ~ 51 kPa (킬로파스칼)의 압력 차동]을 적용합니다. 박테리아 및 부패 유기물을 포함한 총 정지 된 고체 물질은 필터보다 큰 0.45 μm의 기공 크기가 필터에 갇혀 있습니다. 소량의 유기물 및 염과 같은 바이러스 및 용존 고체를 포함한 작은 입자는 멤브레인을 통과하고 표백제가 들어있는 폐기물 용기 진공 플라스크로 전달됩니다.
  8. 필터를 통해 시료의 완전한 통과에 따라, 멸균물의 2~3mL 부피로 깔때기의 내부를 헹구는 다.
  9. 진공을 전원을 끄고 최종 헹구면 매니폴드에서 깔때기를 제거합니다.
  10. 에탄올-화염 살균 포셉을 사용하면 즉시 장치에서 멤브레인 필터를 제거하고 표적 미생물에 대한 적절한 성장 아가로즈 배지에 즉시 배치합니다(표1은 각각에 대한 권장 성장 배지 및 배양 조건을 나열합니다).
  11. 상기 멤브레인 필터를 롤형 모션으로 아가로즈 표면에 적용하여 성장 배지와 멤브레인의 완전한 접촉을 보장하고 기포의 함정을 피한다.
  12. 사용된 여과 깔때기를 각 시료의 처리 사이에 멸균 장치로 교체하고, 교차 오염을 방지하기 위해 스테인레스 스틸 매니폴드를 살균한다.

2. 식민지 열거

  1. 인큐베이션 기간에 따라, 열거하기 위해 인큐베이터에서 성장 판을 제거한다.
  2. 이상적으로, 시원하고 백색 광원을 사용하여 저전력 배율하에서 식민지 수를 수행하십시오.
  3. 총 대장균
    1. 총 대장균 콜로니는 일반적으로 금속 표면 광택과 색상의 어두운 빨간색에 분홍색입니다. 광택 자체는 부분적으로 또는 완전히 식민지를 커버 할 수 있습니다. 비정형 총 대장균 식민지 형태학은 광택없이 어두운 빨간색, 점막, 또는 핵수 있습니다.
    2. 분홍색, 파란색, 흰색 또는 광택이 부족하면서 무색 식민지는 비 대장균으로 간주됩니다.
  4. 대변 대장균
    1. 배설물 대장균 식민지는 파란색의 다양한 음영으로 나타납니다.
    2. 비균 대장균 콜로니는 회색에서 크림색으로 변합니다.
  5. 대변 엔토코커스
    1. 배설물 엔토코치 콜로니가 분홍색에서 진한 빨간색까지 다양합니다.

3. 식민지 검증

  1. 총 대장균
    1. 존재 부재 검증을 위해 멸균 접종 루프를 사용하여 전체 멤브레인을 면봉하십시오. 식민지의 경우, 적어도 5개의 전형적인 비정형 형태학을 확인하는 것이 바람직하다.
    2. 선택한 식민지를 더럼 튜브가 있는 월계수 트립토세 국물을 함유한 유리 용기로 옮기다. 접종된 튜브를 35±0.5°C에서 48h로 배양한다. 가스 생산과 함께 성장을 나타내는 탁도의 존재는 대장균으로 식민지를 확인합니다.
  2. 대변 대장균
    1. 더럼 튜브를 함유한 멸균 EC 배지를 함유한 유리 용기에 무균으로 무균으로 파란색의 콜로니를 옮기. 접종된 튜브를 44.5 ± 0.2°C에서 24시간 동안 배양한다. 가스 생산과 함께 성장을 나타내는 탁도의 존재는 배설물 대장균으로 식민지를 확인합니다.
  3. 대변 엔토코커스
    1. 뇌 심장 주입 Agar (BHIA)에 무균적으로 격리배설장 내구 균형성을 나타내는 스트라이크 콜로니, 24~48시간 동안 35± 0.5°C에서 배양한다.
    2. BHIA의 고립된 식민지에서 두 개의 미리 세척된 유리 슬라이드로 성장을 이전합니다.
    3. 미끄럼에 준비된 얼룩에 과산화수소 3% 2~3방울을 추가합니다. 거품의 급속한 외관은 "카탈라아제 양성" 결과를 나타내며, 분리는 배설물 연쇄상 구균 박테리아가 아닙니다.
    4. "카탈라아제 네거티브"(관찰된 거품 없음)로 테스트를 격리하기 위해 그램 얼룩을 수행합니다. 대변 장구균은 그램 양성, ovoid, 쌍 또는 짧은 사슬에 주로 나타납니다.
대변 세균 지표 추천 미디어
(인큐베이션 온도, 시간) 1
총 대장균 레 엔도 아가르 (35 ± 5 °C, 24 h)
M-엔도 미디엄 (35 ± 5 °C, 24 h)
대변 대장균 m-FC 미디엄 (44.5 ± 0.2°C, 24h)
대변 엔토코커스 m 엔테로코커스 마가르 (35 ± 0.5 °C, 48 h)

표 1. 환경 샘플에서 배설물 세균 지표 검출을 위한 일반적으로 사용되는 배양 성장 매체
1 물 및 폐수 검사표준방법(미국 공중보건 연합 및 미국 수자원 공사 협회, 22일판, 2012)

멤브레인 여과 및 수집 된 박테리아의 후속 배양은 수원의 품질과 청결을 평가하는 유용한 기술입니다.

농업, 레크리에이션 또는 국내 설정에 사용 하기 위해 운명 물의 품질 은 매우 중요 한, 물인 질환의 발생에 대 한 잠재력으로 인해. 물이 동물이나 인간에게서 배설물로 오염되는 경우에, 그 때 병원성 기생충, 박테리아, 또는 바이러스는 그들의 섭취에 새로운 호스트로 퍼질 수 있습니다. 따라서 이러한 질병을 유발하는 유기체에 대한 수원을 모니터링하는 것은 공중 보건을 보장하는 데 매우 중요합니다.

수원으로 존재할 수 있는 배설구 병원균의 깎아지른 듯한 수와 다양성은 각각의 독립적으로 그리고 정기적으로 분석하는 것이 비현실적입니다. 대신, 수질에 대한 일반적인 미생물 학적 분석은 대장균 표시기 박테리아를 활용합니다. 이 과정에 대한 자세한 내용은 표시기 유기체에 대한 이 컬렉션의 비디오를 참조하십시오.

이 비디오는 환경 물 샘플에 막 여과의 과정을 설명하고, 총 대장균, 대변 대장균 및 대변 성균을 포함한 여러 유형의 배설물 표시기 박테리아를 배양하는 방법을 설명하고 배설물 오염의 존재를 확인하는 방법을 설명합니다.

멤브레인 여과 기술은 부정적인 압력을 사용하여 필터및 트랩 박테리아에 걸쳐 물 샘플을 그립니다. 필터는 0.45 μm의 최소 평균 기공 크기를 가진 특수 멤브레인으로, 일반적으로 약 1 μm 크기의 박테리아를 포획할 수 있습니다. 여과 후, 멤브레인은 아가로즈 성장 배지에 적용되고 대상 미생물을 배양하는 데 적합한 조건에서 배양된다.

이 기술은 식수, 수영장, 호수 및 저수지와 같은 낮은 탁도 공급원에 가장 이상적입니다. 미립자 물질 함량이 높은 물은 필터의 파울링 또는 막힘으로 인해 처리될 수 있는 부피를 제한할 수 있습니다. 또한, 멤브레인 여과는 배양 및 배양시 표적 대장균을 열거하는 어려움을 증가시킬 수 있기 때문에 원시 하수와 같은 많은 수원을 포함하는 수원 또는 비 대장균 박테리아에 실용적이지 않습니다.

일단 세균성 견본이 필터에 갇혀 있으면, 그(것)들은 물 견본에 존재하는 표시기 박테리아의 모형을 결정하기 위하여 성장 판으로 옮겨질 수 있습니다. 다른 미디어 유형에 도금은 다른 세균성 유형을 선택하고, 빠른 식별을 허용 할 수 있습니다.

배양 특정 플레이트에 대한 성장 후, 지표 박테리아 정체성의 추가 확인은 액체 매체로 식민지를 따기와 같은 기술을 사용하여 수행 할 수 있으며, 더럼 튜브를 사용하여 가스를 캡처할 수 있으며, 이는 배설물 대장균 또는 총 대장균의 존재에서만 생성되어야합니다. 또한, 의심되는 대변 장구균은 음의 과산화수소-카탈라제 시험과 함께 양수 그램 염색의 조합에 의해 확인될 수 있다.

이제 우리는 물 샘플의 막 여과 뒤에 원리를 잘 알고, 이 절차가 수행되는 방법을 살펴 보자.

절차를 시작하려면 먼저 관심있는 시험 수원에서 물 샘플을 수집합니다. 멸균 1-L 병에 샘플을 채취하십시오. 수집이 완료되면 샘플을 얼음 에 넣고 미생물 분석을 위해 실험실로 운반하십시오.

분석을 시작하려면 먼저 멤브레인 여과 매니폴드를 살균하십시오. 다음으로, 진공 펌프와 표백제가 들어있는 여과 폐기물 플라스크에 매니폴드를 연결합니다.

에탄올 화염 제거 봉제 봉제 및 포장에서 멸균 격자 멤브레인을 제거합니다. 필터를 매니폴드의 멤브레인 여과 영역 의 중앙에 놓고 멸균 필터 깔때기를 장치에 적용한 다음 제자리에 고정합니다.

원하는 양의 테스트 워터를 깔때기에 측정합니다. 부분 진공을 적용하여 필터를 통해 테스트 샘플을 그립니다. 박테리아 및 기타 유기물을 포함한 정지된 고체 물질은 0.45 μm 이상인 필터 안팎에 갇혀 있으며, 작은 입자, 바이러스 및 용존 고형체는 표백제가 들어있는 폐기물 플라스크에 전달됩니다.

샘플이 필터를 통과 한 후, 멸균 물의 25 mL로 깔때기의 내부를 3 번 헹구어 필터를 통과 할 수 있습니다. 최종 헹구기가 완료되면 진공을 분리하고 매니폴드에서 깔때기를 제거합니다.

다음으로, 에탄올 화염 살균 포셉은 즉시 장치에서 멤브레인 필터를 제거합니다. 압연 동작을 사용하여 대상 미생물에 적합한 성장 판에 놓아 표면과의 완전한 접촉을 보장하고 기포를 포획하지 마십시오.

각 추가 시료의 처리를 위해 스테인레스 스틸 매니폴드를 살균하고 멸균 깔때기를 사용하여 교차 오염을 방지합니다. 마지막으로, 적절한 인큐베이션 기간 동안 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.

인큐베이션 기간에 따라 열거하기 위해 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 가능하면 시원한 백색 광원을 사용하여 저전력 배율하에서 콜로니 카운트를 수행하십시오. 총 대장균을 결정하려면 분홍색으로 어두운 빨간색으로 보이는 식민지를 식별하고 계산하고 금속 표면이 식민지를 완전히 또는 부분적으로 덮습니다. 비정형 총 대장균 콜로니는 광택없이 어두운 빨간색, 점막, 또는 핵으로 나타날 수 있습니다.

광택없이 파란색, 흰색, 무색 또는 분홍색으로 나타나는 식민지는 비 대장균으로 간주되며 총 대장균 수에 포함되어서는 안됩니다.

배설물 대장균 콜로니는 다양한 파란색 음영으로 나타나며, 이들은 별도의 범주로 계산되어야합니다. 비 배설물 대장균 콜로니는 일반적으로 회색에서 크림색으로, 또한 개별 범주에 기록되어야 합니다. 마지막으로, 배설물 엔토구치 콜로니는 분홍색에서 어두운 빨간색에 이르기까지 다양하며 별도로 계산해야합니다.

총 대장균 식민지를 확인하려면 소독되고 냉각된 접종 루프를 단일 콜로니콜로 적용합니다. 선택한 식민지를 월계수 트립토제 국물과 더럼 튜브가 들어 있는 유리 용기로 옮는다. 다음으로 문화를 인큐베이터에 넣습니다. 더럼 튜브에 의해 캡처 된 가스 생산과 함께 탁도의 존재는 총 대장균으로 식민지를 확인합니다.

배설물 대장균 검증을 위해, 무균 EC 배지와 더럼 튜브를 포함하는 유리 용기에 색으로 파랑을 무균 적으로 옮기. 접종된 튜브를 인큐베이터에 넣습니다. 인큐베이션 후, 편탁증은 가스 생산과 함께 식민지를 배설물 대장균으로 확인한다.

대변 장구균을 확인하기 위해, 무균뇌 심장 주입 Agar 플레이트에 올바른 형태와 의심 식민지를 전송하고, 인큐베이션. 다음으로, BHIA의 고립된 식민지에서 두 개의 멸균 유리 슬라이드로 성장을 이송합니다.

유리 슬라이드 중 하나에 과산화수소 3 % 2-3 방울을 추가합니다. 급속가스 생산은 시트로박터와같은 카탈라제 양성 박테리아를 나타낸다. 대변 장구균 박테리아는 카탈라아제 음성; 따라서 버블링이 관찰되지 않습니다. 버블블링을 표시하지 않는 카탈라제 네거티브 콜로니의 경우 그램 얼룩을 수행하십시오. 대변 장구균으로, 이들은 그람 양성 나타납니다, 모양에 없는, 쌍 또는 짧은 사슬에 주로 그룹화.

수원에서 이러한 지표 박테리아를 찾는 것은 오염의 존재를 나타냅니다. 샘플의 5% 이상이 1개월 동안 오염된 것으로 밝혀지면, 이 공급원은 인간의 소비에 적합하지 않은 것으로 간주될 수 있다.

막 여과는 일반적으로 다수의 생물학적 응용 분야에서 사용되며, 대변 표시기 유기체는 다른 실험 적 절차에 의해 검출 될 수있다. 이러한 응용 프로그램 중 일부는 여기에서 탐색됩니다.

막 여과는 또한 물 샘플에서 바이러스 포획에 사용할 수 있습니다. 바이러스는 일반적으로 매우 낮은 수준에 존재하기 때문에, 물 샘플은 분석을 위해 그들을 캡처하기 위해 집중해야합니다. 포획된 바이러스는 필터로부터 방출될 수 있고, 세포 배양 감염성 소법 또는 PCR과 같은 기술을 사용하여 식별될 수 있다.

멤브레인 여과는 또한 산업 또는 실험실 사용을 위한 고순도 물의 생산에 활용된다. 많은 산업에서 는 운영 공정을 위해 고도로 정제된 물을 필요로 하며, 멤브레인 여과는 원치 않는 용존 금속과 물에서 소금을 포함한 오염 물질을 제거하는 역할을 할 수 있습니다. 또한 식수를 생산하기 위해 바닷물의 담수화에 사용할 수 있습니다.

막 여과에 의해 물에서 지표 유기체를 식별하는 JoVE의 소개를 방금 지켜보았습니다. 이제 막 필터 물 샘플을 하는 방법, 멤브레인에서 대변 표시기 박테리아의 여러 종류를 배양 하는 방법, 그리고 표시기 유기 체로 이들을 확인 하는 방법. 시청해 주셔서 감사합니다!

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Applications and Summary

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막 여과는 바이러스 포획 및 물에서 농도에 사용 됩니다. 인간 병원성 바이러스는 수생 솔루션에서 순 음전하를 지니고 있으며, 종종 수원의 낮은 수준에서 존재합니다. 따라서 분석 하기 전에 집중 해야 합니다. 멤브레인 여과는 이 목적을 위해 하나의 캡처 방법일 뿐이며 음전하 필터를 사용합니다. 물의 시료(예를들어 1-L)는 바이러스에 양성 전하를 부여하기 위해 염액(예를들어염화 마그네슘)으로 개정되어 물이 여과될 때 음전하 하 멤브레인 필터에 흡착을 용이하게 한다. 저농도 산용액은 멤브레인을 헹이고 과도한 염을 제거하는 데 사용됩니다. 수산화 나트륨의 낮은 농도 및 부피는 그 때 추가 농도 및 분석전에 필터로부터 바이러스를 방출하기 위하여 이용됩니다(예를 들어 세포 배양 감염성 분석 또는 정량적인 PCR).

멤브레인 여과는 또한 산업용 고순도 공정 용 물의 생산에도 활용된다. 많은 산업에서 운영 프로세스에 고도로 정제된 물이 필요합니다. 멤브레인 여과(예를 들어 나노 여과)는 물에서 용존 금속 및 소금을 포함한 오염 물질을 제거하는 역할을합니다. 멤브레인 여과는 또한 식수를 생산하기 위해 바닷물의 담수화에 사용됩니다.

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Transcript

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