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Administração Composta IV

Overview

Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Universidade de Notre Dame, IN

Existem muitas rotas comumente usadas para administração composta em ratos e ratos de laboratório. Os protocolos podem, no entanto, exigir o uso das rotas menos utilizadas: intracardiac, footpad e injeções retro-orbitais. O treinamento especializado é essencial para que esses procedimentos sejam realizados com sucesso. A justificativa para essas rotas pode precisar ser fornecida para obter a aprovação do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC).

Principles

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A administração intracardiac tem sido usada em uma variedade de aplicações, incluindo o desenvolvimento de um modelo animal de metástase do câncer ósseo, bem como um exame dos efeitos da entrega direta de intracardiac no resultado do infarto do miocárdio. Este procedimento é frequentemente feito através do uso de um ultrassom para guiar a agulha para o local correto no coração. 2 No entanto, quando realizado corretamente utilizando os marcos adequados, este procedimento pode ser realizado sem o uso de visualização de ultrassom.

Devido à natureza invasiva do procedimento, o uso da injeção intracardiac deve ser cientificamente justificado em um protocolo da IACUC. Só uma injeção de sobrevivência deve ser permitida. Este procedimento requer o uso de um anestésico geral, inalador ou injetável, conforme as diretrizes estabelecidas dentro de uma organização. A seleção da agulha deve ser o menor tamanho possível que permitirá a viscosidade do material injetado; geralmente, uma agulha de calibre 27-30 é usada. Os volumes de injeção variam de 100 μL a um máximo de 300 μL.

Injeções intravenosas na cauda de camundongos são desafiadoras e muitas vezes mal sucedidas. Uma rota alternativa de administração intravenosa é através do plexo retro-orbital. Embora esta técnica exija treinamento e habilidade para ser exetre, estudos têm mostrado que há uma taxa de sucesso maior com a injeção retro-orbital do que com injeção lateral da veia da cauda. 3, 4, 5 A anestesia é necessária para evitar que o rato se mova durante o procedimento. A anestesia inalante geral entregue através de um frasco de sino ou de uma câmara de indução anexada a um vaporizador de precisão é eficaz. No entanto, se o inalador for utilizado, saiba que o animal começará a se recuperar rapidamente assim que for retirado da câmara, por isso deve-se estar pronto para realizar a injeção. Recomenda-se um anestésico oftalmológico tópico (tetracaína ou procaína) quando múltiplas injeções devem ser realizadas.

A estrutura venosa orbital do rato e do rato são diferentes. O camundongo tem um seio ou convergência de várias naves, incluindo a veia supraorbital, veia nasal dorsal, a veia palpebral inferior, e as veias temporais superficiais que preenchem o espaço na órbita ao redor do olho. Na área orbital do rato, há uma rede ou plexo de vasos. Como em todas as injeções, a agulha selecionada deve ser o menor tamanho possível; geralmente uma agulha calibre 27-30. Embora tenha havido relatos de volumes maiores, o volume máximo é de 150 μL por olho. 3, 4, 5 Recomenda-se uma injeção por olho, por dia, com um total de duas injeções por olho para procedimentos de sobrevivência. Além disso, deve haver pelo menos um intervalo de um dia entre as injeções. Para um procedimento não-supergêvival, podem ser administrados volumes de até 500 μL.

Apesar da controvérsia, o uso da almofada para o pé como local de injeção ainda é necessário para alguns estudos. Foi demonstrado que quando injetado através da almofada do pé, a resposta de anticorpos em algumas cepas de camundongos foi significativamente mais forte do que quando injetado no hock. 6 Todos os animais devem ser monitorados de perto para sinais de dor, nível de consumo alimentar e para ambulação normal. A automutilação do pé pode ocorrer na medida em que o pé está sendo destruído. Isso é um sinal de dor crônica. Qualquer animal que demonstre automutilação deve ser chamado imediatamente à atenção da equipe veterinária.

As medições do footpad devem ser feitas diariamente assim que o inchaço óbvio ocorrer. Os pontos finais devem estar em vigor de acordo com as diretrizes da IACUC. Geralmente, o animal deve ser eutanizado quando a lesão ou tumor interfere na capacidade do animal de ambulagar ou alcançar alimentos e água. O volume máximo que pode ser injetado em um footpad é de 50 μL. Recomenda-se uma agulha calibre 29-30 para a injeção.

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Procedure

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1. Injeção de intracardiac

  1. Marcos e posicionamento: Posicione o rato ou rato na recumbência lateral direita (com o lado esquerdo voltado para cima) ou em recumbência dorsal, e identifique os marcos.
    1. Posicione o coração aproximadamente nivelado com o ponto do cotovelo e apenas à esquerda do esterno.
    2. Insira a agulha entre as costelas na ponta do cotovelo.
    3. Em um animal em recumbência dorsal, insira a agulha no peito paralelo à mesa.
    4. Em um animal em recumbência lateral, insira a agulha no perpendicular do peito à mesa.
  2. Injeção do artigo
    1. Certifique-se de que há um movimento mínimo da agulha uma vez que ela é inserida no coração para evitar que o músculo seja rasgado e cause sangramento no saco pericárdico, pois isso compromete a função cardíaca.
    2. Aspire a seringa para determinar a colocação adequada. Muitas vezes há um flash de sangue no centro da seringa.
    3. Segure a seringa para que a mão não seja reposicionada na seringa para injeção uma vez que a agulha tenha sido posicionada no coração.
    4. Injete o artigo de forma lenta e constante.
    5. Retire a agulha lentamente para minimizar o sangramento.
    6. Camundongos que experimentam problemas respiratórios, convulsões, cianose, ataxia prolongada ou outras sequelas relacionadas ao trauma de injeção devem ser avaliados pela equipe veterinária e eutanásia de acordo com sua recomendação.

Figure 1
Figura 1. Injeção intracardiac em camundongos.

2. Injeção intravenosa utilizando o plexo retro-orbital

  1. Marcos de injeção e posicionamento
    1. Coloque o animal sobre uma superfície plana em recumbência lateral.
    2. Insira a agulha no canthus medial do olho em um ângulo de 45° no nariz.
    3. A profundidade da agulha deve ser suficiente para penetrar os tecidos conjuntivistas e avançar atrás da órbita ocular e para o plexo ocular. Ao colocar a agulha, ela não deve encontrar o osso na parte de trás da órbita.
    4. Coloque o dedo indicador na parte superior da cabeça com o polegar na mandíbula.
    5. Puxe suavemente para trás e para baixo para apertar a pele e saliência do globo ocular.
    6. Tome cuidado para não aplicar pressão sobre a traqueia e restringir o fluxo de ar.
  2. Injecção
    1. Coloque a agulha atrás do olho e não intra-ocularmente.
    2. Certifique-se de que a agulha tenha um movimento mínimo uma vez inserido no plexo retro-orbital, ou os vasos se romperão causando sangramento e perda do agente nos tecidos atrás do olho. Segure a seringa para que a mão não seja reposicionada na seringa para injeção uma vez que a agulha tenha sido posicionada no plexo retro-orbital.
    3. Não aspire com a seringa, pois você vai colapsar os vasos.
    4. Injete o artigo de forma lenta e constante.
    5. Retire a agulha e aplique pressão leve no olho para controlar o sangramento e proporcionar hemostasia.
    6. Camundongos que experimentam inchaço, conjuntivite ou outras sequelas relacionadas ao trauma de injeção devem ser avaliados pela equipe veterinária e tratados ou eutanásiados de acordo com sua recomendação

Figure 2
Figura 2. Injeção orbital retrô em camundongos.

3. Injeção de footpad

  1. Para a contenção, coloque o animal em um tubo de contenção com um pé traseiro isolado, e estenda-se segurando a pele acima do sufoto.
  2. Limpe o pé com água ou álcool para remover detritos antes de injetar.
  3. Injete subcutâneamente no centro do pé traseiro formando uma pequena sangria no local da injeção. Para evitar o vaso sanguíneo que percorre o comprimento do pé, injete apenas fora da linha média paralela ao vaso.

Figure 3
Figura 3. Injeção de footpad em ratos e ratos.

Intracardiac, orbital retrô e footpad são alguns dos métodos especializados de injeção que os pesquisadores biomédicos usam para experimentos que necessitam de entrega de compostos através dessas rotas atípicas.

Uma injeção intracardiac fornece o composto no ventrículo esquerdo permitindo que a substância entre diretamente na circulação arterial. A rota orbital retrô é uma alternativa à injeção da veia da cauda e é usada para entregar o composto na circulação venosa. E uma injeção de footpad envolve administração subcutânea do artigo no pé traseiro do animal. Este vídeo ilustrará as considerações, procedimentos e aplicações dessas técnicas especiais de injeção.

Vamos começar com algumas informações de fundo e coisas que se deve considerar antes de iniciar esses procedimentos administrativos.

A administração intracardiac é frequentemente feita através do uso de um ultrassom para guiar a agulha para o local correto no coração. No entanto, se realizada corretamente utilizando os marcos adequados, a administração pode ser realizada sem o uso de visualização de ultrassom. Observe que o procedimento requer o uso de um anestésico geral, e apenas uma injeção por animal é permitida para procedimentos de sobrevivência. Geralmente uma agulha de calibre 27-30 é usada para esta injeção e o volume máximo de administração é de 100 e 300 microlitres para ratos e ratos, respectivamente.

Para injeção intravenosa através da rota orbital retrô, deve-se ter uma compreensão justa da estrutura venosa orbital. Um rato tem um seio onde várias veias- ou seja, as nasais supraorbitais, dorsais, inferiores palpebrais e superficiais temporais convergem. Enquanto em ratos, há uma rede ou plexo de várias veias. A injeção é realizada diretamente no seio ou no plexo. Como intracardiac, este procedimento também requer o uso de anestesia geral, e apenas uma injeção por olho por dia é recomendada com um total de duas injeções por olho para procedimentos de sobrevivência. Como em todas as injeções, a agulha de menor tamanho deve ser selecionada-geralmente 27-30 bitola - e o volume máximo recomendado é de 150 μL por olho.

Apesar da controvérsia, o uso da injeção de footpad ainda é necessário para alguns estudos, tipicamente relacionados à inflamação e ao crescimento do tumor. Note que as injeções só podem ser realizadas em um pé, nunca bilateralmente. E as medidas do footpad devem ser feitas diariamente assim que o inchaço óbvio ocorreu. Recomenda-se uma agulha de calibre 29-30 para a injeção e o volume máximo recomendado é de 50 μL. Após qualquer injeção, todos os animais devem ser monitorados de perto para sinais de dor, nível de consumo alimentar e para ambulação normal. Geralmente o animal deve ser eutanizado quando a lesão ou tumor interfere com a capacidade do animal de ambular ou alcançar a comida e a água.

Agora vamos aprender os procedimentos de injeção, começando com a injeção intracardiac. Vamos demonstrar o procedimento em um rato, mas os marcos e o protocolo para um rato são semelhantes.

O primeiro passo é preparar a seringa. Lembre-se que uma agulha calibre 29 e uma seringa de 1 cc são apropriadas para ratos. E o volume máximo para injeção intracardiac é de 100 microliters. Ao desenhar a solução, deixe uma pequena quantidade de ar entre o êmbolo e o material de injeção. Isto é para permitir que o sangue entre na seringa enquanto é colocado no coração.

Para começar, anestesia o animal usando anestésicos inalador ou injetável. Reveja as considerações para manter a anestesia geral em outro vídeo desta coleção. Em seguida, posicione o animal em posição de recumbência dorsal em uma plataforma isolada. Em seguida, grave os membros dianteiros na plataforma e coloque um pedaço de fita horizontalmente através do abdômen acima dos quadris. Isto é para estabilizar ainda mais o animal e evitar qualquer movimento uma vez que a agulha tenha sido inserida. Em seguida, usando um cotonete, molhe o peito do animal com 70% de álcool.

Para identificar o local da injeção, primeiro localize o xifoide e o esterno do manúbrio. Então, encontre o ponto médio entre os dois marcos. 1-2 mm à esquerda deste ponto, é o marco de inserção da agulha. Usando um aplicador de ponta de algodão, aplique iodo povidone para marcar o local de inserção da agulha.

Para injetar, direcione a agulha perpendicular à mesa e insira-a na profundidade de cerca de 2 mm. Em seguida, aplique uma leve pressão traseira no êmbolo. Um sangue oxigenado vermelho brilhante deve entrar no centro de seringa, o que confirma a colocação adequada. Segure a seringa no mesmo local e injete o material lentamente e de forma constante ao longo de 30 a 60 segundos. A injeção rápida pode resultar em aglomerados das células e entupimento das artérias, um choque no sistema devido à temperatura da substância ser significativamente menor que a temperatura corporal, ou uma expansão do ventrículo e interrupção do ritmo cardíaco.

Uma vez que o material tenha limpado a seringa, lentamente e cuidadosamente remova a agulha sem qualquer movimento lateral, pois isso pode danificar os músculos cardíacos. Em seguida, solte imediatamente a fita das pernas dianteiras e abdômen e coloque o animal em posição propensa em uma gaiola limpa com roupa de cama suficientemente profunda para agir como uma camada isolante. Note que metade desta gaiola de recuperação está em uma fonte de aquecimento e o animal anestesiado está situado no lado aquecido da gaiola. Isso evita hipotermia, e à medida que o animal se recupera da anestesia, ele poderá sair do lado aquecido conforme desejado.

Em seguida, vamos aprender o método de injeção intravenosa utilizando o plexo retro-orbital em ratos. Mais uma vez, vamos demonstrar o procedimento em um rato, mas os marcos e o protocolo para ratos são semelhantes.

Conecte a agulha apropriada à seringa selecionada e preencha o material de injeção. Lembre-se, geralmente se usaria uma agulha calibre 27-30 com a menor seringa possível e um volume máximo de 150 microlitadores.

Para iniciar o procedimento, primeiro anestesiar o animal. Em seguida, coloque-o sobre uma superfície plana em posição de reclinância lateral. Agora coloque seu dedo indicador na parte superior da cabeça e o polegar na mandíbula, e puxe suavemente para trás e para baixo. Isto é para apertar a pele e saliência do globo ocular. Tome cuidado para não aplicar pressão sobre a traqueia e restringir o fluxo de ar. Se planejar múltiplas injeções, aplique anestésico oftalmológico tópico, como tetracaína ou proparacaína.

Insira a agulha no canthus medial do olho em um ângulo de 45° no nariz. A profundidade deve ser suficiente para penetrar os tecidos conjuntivistas e avançar para a órbita ocular e para dentro do seio. Ele não deve encontrar o osso na parte de trás da órbita. Para evitar a ruptura dos vasos sanguíneos, certifique-se de que a agulha tenha um movimento mínimo uma vez inserida. Não aspire, pois isso vai colapsar os vasos. Injete o artigo de forma lenta e constante. Em seguida, retire a agulha suavemente e aplique pressão leve no olho para controlar o sangramento e para fornecer hemostasia.

Por último, vamos rever o método de injeção de footpad em ratos e ratos. Para iniciar, conecte a agulha apropriada e encha a seringa com o volume correto. Este procedimento pode ser feito em animais conscientes.

Coloque o animal em um tubo de contenção com um pé traseiro isolado e estendido segurando a pele acima do sufocamento. Limpe o pé com água ou álcool para remover detritos antes de injetar. Para evitar o vaso sanguíneo que percorre o comprimento do pé, o marco da injeção está no centro, mas apenas fora da linha média, mais perto dos dedo do pé.

Coloque a agulha no local da injeção direcionando-a para o calcanhar. Injete o artigo de forma lenta e constante para evitar a rápida distensão dos tecidos do pé. Isso fará com que o footpad incha à medida que o material de injeção preenche esse espaço subcutâneo. No pé de um pequeno animal o inchaço da injeção pode se estender até o calcanhar, enquanto em um animal maior ele será mais localizado.

Após a injeção, observe os animais diariamente e se houver inchaço persistente ou se houver lesões ou tumores como resultado do protocolo experimental, então, usando uma pinça, realize a medição do footpad. Este instrumento mede a espessura do pé em milímetros e ajuda na quantitação do inchaço.

Agora vamos discutir alguns experimentos de exemplo utilizando injeções intracardiac, orbitais retrô e footpad.

Uma das muitas aplicações da administração intracardiac é o desenvolvimento de um modelo animal de metástase cancerísia. Aqui, os pesquisadores usaram essa rota para injetar células tumorais que possuem propensão para a colonização óssea. Nos dias seguintes, estudaram o crescimento tumoral em ossos usando técnicas de raio-X e imagens de fluorescência. Em outro estudo, a rota orbital retrô foi usada para injetar anticorpos específicos que rotulam neutrófilos. Então, com a ajuda da imagem intravital, os cientistas foram capazes de rastrear o padrão de migração das células rotuladas.

Por fim, os pesquisadores geralmente usam injeção de footpad para analisar a resposta inflamatória. Neste experimento, os pesquisadores isolaram as células mononucleares de sangue periféricos de amostras de sangue humano, misturaram-nas com diferentes antígenos de teste e injetaram as soluções no footpad do animal. Finalmente, realizaram medições de pé para quantificar a resposta ao inchaço devido a diferentes antígenos.

Você acabou de assistir a última parte da JoVE sobre as técnicas habituais e especializadas de administração composta.

Só para recapitular, na primeira parte revisamos a rota parenteral mais comum. No segundo capítulo, discutimos os procedimentos enterais e tópicos. A terceira parcela tratou do primeiro conjunto de procedimentos atípicos como intradérmico, intranasal e intracraniano em recém-nascidos. Por fim, aqui discutimos três rotas adicionais que os pesquisadores biomédicos usam em laboratórios para fins específicos.

Depois de assistir a esta série você deve ter uma compreensão muito melhor das diferentes técnicas de administração e você também deve conhecer as considerações gerais e específicas relacionadas a esses protocolos de administração composta Como sempre, obrigado por assistir!

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Applications and Summary

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A administração de compostos em animais pode ter um efeito significativo tanto no bem-estar do animal quanto no resultado dos dados experimentais e do valor científico. O método adequado de entrega é essencial para o sucesso do experimento. Muitos fatores devem ser considerados para determinar o melhor caminho, incluindo o objetivo científico do estudo, o pH da substância, o volume de dosagem necessário, a viscosidade da substância e o bem-estar dos animais. A perícia técnica também é um requisito para todos os métodos de injeção.

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References

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Transcript

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