Overview
Fonte: Kay Stewart, RVT, RLATG, CMAR; Valerie A. Schroeder, RVT, RLATG. Università di Notre Dame, IN
Ci sono molte vie comunemente usate per la somministrazione di composti in topi e ratti di laboratorio. Tuttavia, alcuni protocolli possono richiedere l'uso di vie meno comunemente usate, tra cui iniezioni intratradermali, intranasali e intracranica. La formazione specializzata è essenziale affinché queste procedure vengano eseguite con successo. Potrebbe essere necessario fornire una giustificazione per questi percorsi per ottenere l'approvazione del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC).
Principles
Le liniezioni intradermiche vengono consegnate negli strati esterni del derma, sotto lo strato superiore della pelle (l'epidermide). Questa via di iniezione è solitamente riservata alla valutazione dell'infiammazione, alla diagnostica del flusso sanguigno cutaneo o alle reazioni allergeniche a un antigene.
Sebbene spesso utilizzato per la somministrazione locale di vaccinazioni o spray decongestionante, la somministrazione intranasale può essere utilizzata anche per la somministrazione sistemica e del sistema nervoso centrale (SNC). La mucosa che riveste la cavità nasale ha un ricco apporto di vasi sanguigni e nervi che consentono un rapido assorbimento sistemico e un targeting diretto al SNC. Le sostanze composte da piccole molecole lipofile hanno un tasso di assorbimento molto maggiore rispetto a quelle contenenti molecole più grandi. 2
Sebbene l'anestesia non sia richiesta per questa procedura, può facilitare il corretto posizionamento del composto alle narici, garantendo un dosaggio accurato. È stato dimostrato che gli animali anestetizzati hanno una consegna cinque volte maggiore di un farmaco al cervello rispetto a un animale cosciente. 2 I ratti non non intestituiti sono molto resistenti alla somministrazione intranasale. Tuttavia, esiste uno studio che ha dimostrato tecniche di consegna efficaci per la somministrazione intranasale di ratti che si muovono liberamente. 3 Inoltre, gli animali attenti possono tentare di mordere la punta della pipetta o l'ago, rendendo difficile la consegna della sostanza.
I vantaggi della somministrazione intranasale sono che questa tecnica richiede un addestramento e un'abilità minimi e non è invasiva per l'animale. Tuttavia, a causa della possibilità di aerosolizzazione, si consiglia l'uso di un armadietto di biosicurezza e di una protezione per gli occhi, specialmente quando si lavora con un animale cosciente. Inoltre, per evitare di annegare gli animali, deve essere utilizzata la dose più piccola possibile. Se in qualsiasi momento durante questa procedura si vedono cianosi, respirazione della bocca o altri segni di angoscia nell'animale, la procedura deve essere interrotta immediatamente.
Le iniezioni intracranico in topi e ratti adulti impiegano l'uso di apparecchiature stereotassessica per garantire il corretto posizionamento e la profondità dell'iniezione. Tuttavia, nei topi da 3 a 28 giorni di età e nei ratti fino a 14 giorni di età, il cranio è abbastanza sottile da iniettare direttamente attraverso di esso; è troppo fragile per supportare il dispositivo stereotassico. I cuccioli di topo o di ratto devono essere lasciati con la madre fino alla procedura e devono essere restituiti a lei il prima possibile una volta completata la procedura. La cura postinjection include il monitoraggio continuo su una fonte di calore fino a quando non si osservano movimenti e comportamenti normali, compresa l'allattamento. Il motivo principale per utilizzare questa tecnica è quello di fornire agenti farmacologici al sistema nervoso centrale che richiedono l'attraversamento della barriera emato-encefalica, o per evitare gli effetti coinvolti nella via sistemica. 1
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Procedure
1. Somministrazione intradermica
- La maggior parte delle iniezioni intradermiche sono composti a base acquosa. Le soluzioni devono essere tamponate fisiologicamente per avere un pH neutro, al fine di evitare necrosi tissutale nel sito di iniezione.
- La gamma di dimensioni dell'ago è di 25-30 gauge, la più piccola possibile.
- L'intervallo di dosaggio per sito di iniezione è di 50-100 μL. L'iniezione di volumi eccessivi può provocare necrosi nel sito di iniezione o perdite del composto fuori dal sito a causa della pressione.
- Per un posizionamento accurato dell'ago nello spazio intradermico, è necessario anestetizzare sia topi che ratti. L'anestesia per inalazione consente una rapida induzione e recupero; tuttavia, l'anestesia iniettabile ha il vantaggio di fornire ampio tempo per la preparazione dell'area e l'esecuzione dell'iniezione. 1
- Rimuovere i capelli nel sito di iniezione attraverso l'uso di una crema depilatoria o radendo l'area.
- Rimuovere accuratamente eventuali residui di crema depilatoria o detriti di capelli.
- Applicare un antisettico topico, come una soluzione di iodio, una soluzione di clorexidina o alcol.
- Procedure amministrative
- Allunga la pelle tesa tra il pollice e l'indice. Ciò fornisce stabilità alla pelle durante il posizionamento dell'ago.
- Posizionare la smussatura dell'ago sulla pelle.
- Inserire delicatamente l'ago nella pelle tra l'epidermide e il derma. Avanzare l'ago appena oltre la smussatura.
- Iniettare la sostanza lentamente. L'iniezione del composto creerà un bleb, o una piccola vescica, nella pelle.
- Pausa dopo l'iniezione per consentire alla pelle di allungarsi e regolarsi prima di ritirare l'ago.
- Precauzioni
- Non è necessario tirare indietro lo stantuffo.
- Se l'ago viene inserito nello spazio sottocutaneo, non si forma alcuna bleb. L'iniezione troppo profonda provoca un'iniezione sottocutanea.
- Evitare di pulire o pulire l'area, in quanto ciò può causare la fuoriuscita del composto dal sito di iniezione.
- Quando si eseguono iniezioni multiple, distanziarle in modo che le macchie non si sovrappongano.
Figura 1. Iniezione intradermica nei topi.
2. Somministrazione intranasale
- Attrezzatura
- Utilizzare una pipetta per unità di micropipettaggio che può essere calibrata per fornire un volume accurato.
- Le punte delle pipette monouso devono essere utilizzate per evitare la contaminazione incrociata. Siringhe TB, aghi smussati e tubi flessibili possono anche essere utilizzati per il dosaggio.
- I volumi totali di iniezione per i ratti non devono superare i 40-100 μL e devono essere somministrati in gocce da 6-10 μL. Per i topi, il volume totale massimo è di 24 μL, dato in gocce di 3-4 μL.
- Somministrazione in animali coscienti
- La contenzione manuale negli animali coscienti richiede che la testa sia relativamente immobile in modo che la punta della pipetta o l'ago smussato possano essere posizionati abbastanza vicino alle narici per fornire il composto, ma non così vicino da colpire o lacerare il tessuto nasale.
- Trattenere l'animale e tenerlo in posizione verticale.
- Posizionare una piccola goccia di un composto liquido all'apertura nasale. L'animale dovrebbe inalare la goccia.
- Somministrare un volume aggiuntivo, alternando le narici fino a quando l'intero volume è stato dato.
- Quando si somministrano volumi maggiori, è importante non restringere il torace durante la contenzione. La compressione toracica impedisce alla capacità dell'animale di fare respiri sufficientemente profondi per attirare il liquido nei bronchi e nei polmoni.
Figura 2. Somministrazione intranasale in topi coscienti.
- Somministrazione in animali incoscienti
- L'uso di anestetici per inalazione consente un animale immobilizzato durante l'avvicinamento e la consegna del composto. Ciò elimina la possibilità che l'animale morda l'attrezzatura di dosaggio, la perdita del composto a causa di scatti della testa e lesioni al tessuto nasale, agli occhi o alla pelle del viso dell'animale. L'animale ha anche meno probabilità di sbuffare e spruzzare il composto dalle narici al momento della somministrazione.
- Metti l'animale in posizione supina. La posizione della testa influenza il posizionamento della soluzione nelle narici. È stato dimostrato che la posizione ideale per la consegna del SNC è con l'animale supino; questo permette un migliore assorbimento. 2
- Somministrare metà del composto direttamente in un lato dell'apertura nasale, cronometrandolo con l'inalazione. Quindi, gira l'animale.
- Come sopra, somministrare l'altra metà del volume nell'altra apertura nasale.
Figura 3. Somministrazione intranasale in topi incoscienti.
3. Somministrazione intracranica in topi e ratti neonatali
- Topi o ratti devono essere anestetizzati per iniezioni intracranico.
| Topo | Ratto | ||
| Età (giorni) | Calibro dell'ago (g) | Età (giorni) | Calibro dell'ago (g) |
| 0-7 | 29-30 | 0-5 | 27-29 |
| 7-14 | 27 | 5-10 | 25-27 |
| 14-28 | 25 | 10-14 | 25 |
| Età (giorni) | Lunghezza ago (mm) | Età (giorni) | Lunghezza ago (mm) |
| 0-7 | 2 | 0-4 | 2-3 |
| 7-14 | 3 | 4-7 | 3 |
| 14-21 | 4 | 7-10 | 4 |
| 21-28 | 5 | 10-14 | 5 |
| Età (giorni) | Volume (μL) | Età (giorni) | Volume (μL) |
| 0-5 | < 20 | 1-3 | < 20 |
| 6-20 | < 60 | 4-10 | < 60 |
| 20-28 | < 100 | 11-14 | < 100 |
Tabella 1. Calibro dell'ago, lunghezza dell'ago e volume massimo di somministrazione intracranica secondo l'età di topi e ratti. 4
- Attrezzatura
- Determinare il misuratore dell'ago corretto e il volume massimo di somministrazione come da Tabella 1.
- Preparare una protezione dell'ago prima di anestetizzare l'animale.
NOTA: La profondità di iniezione dell'ago è controllata attraverso l'uso di una protezione creata con il cappuccio dell'ago.- Per creare la protezione, un ago viene misurato rispetto al cappuccio dell'ago e un segno viene posto sul cappuccio per indicare dove tagliare. Il taglio deve essere effettuato in modo che da 2 a 5 mm dell'ago siano esposti quando il cappuccio viene sostituito sull'ago.
- La lunghezza dell'ago esposto deve essere abbastanza lunga da penetrare nella pelle e nel cranio e raggiungere la profondità desiderata nel cervello.
- Le lunghezze degli aghi necessarie per topi e ratti sono elencate nella Tabella 1.
- È necessaria una fonte di riscaldamento per prevenire l'ipotermia nei cuccioli. Esistono diversi tipi: una piastra riscaldante elettrica impostata sul basso, una coperta d'acqua circolante o una sacca di calore a reazione chimica riutilizzabile.
- Limitazione
- I cuccioli di topo e ratto di 10 giorni o più giovani non richiedono anestesia per questa procedura. Tratteneteli manualmente tenendoli appena dietro la testa e tirando caudale la pelle per mettere una leggera pressione sulle spalle.
- Anestetizzare i cuccioli di età superiore ai 10 giorni con inalazione di isoflurano. Collegare una camera di induzione a un vaporizzatore di precisione o un barattolo a campana con un batuffolo di cotone imbevuto di isoflurano. Una volta che il cucciolo è immobilizzato, l'anestesia è efficace per circa 40 secondi, il che fornisce ampio tempo per l'iniezione.
- Tecnica di iniezione
- Aspirare la sostanza nella siringa e posizionare la guida del cappuccio/ago sull'ago.
- Il volume di iniezione raccomandato come volume massimo per topo o ratto neonatale è di 100 μL e quello per topi svezzati o anziani è fino a 300 μL.
- Per iniettare nella corteccia cerebrale dei neonati, inserire l'ago 5 mm dietro l'occhio, a circa 3 mm dalla linea mediana del cranio.
- Il sito di iniezione del topo di svezzamento è approssimativamente a metà strada tra l'occhio e l'orecchio e appena fuori dalla linea mediana.
Figura 4. Somministrazione intracranica in un cucciolo di topo.
A volte, diversi approcci sperimentali richiedono l'uso di vie meno comunemente impiegate di somministrazione di composti nei roditori. Intradermale, intranasali e intracranici sono tre di tali percorsi alternativi che i ricercatori biomedici usano oggi nei laboratori.
Come suggerisce il nome, l'intradermica sta fornendo composti negli strati esterni del derma. Intranasale sta posizionando la soluzione nelle narici dell'animale. E l'intracranico comporta l'inserimento dell'ago direttamente nel cervello del roditore.
La formazione specializzata è essenziale per eseguire con successo queste procedure. Qui, illustreremo prima le considerazioni per ciascuno di questi metodi e poi dimostreremo le tecniche che ti aiuteranno a imparare le procedure garantendo al contempo la sicurezza dell'animale e il successo dell'esperimento.
Iniziamo con la discussione su quando questi percorsi sono solitamente impiegati e cose che si dovrebbero tenere a mente prima di iniziare a eseguire queste tecniche di amministrazione specializzate.
Le iniezioni intradermiche vengono utilizzate per consegnare un articolo nello spazio tra l'epidermide e il derma Questa via è solitamente riservata alla valutazione dell'infiammazione, alla diagnostica del flusso sanguigno cutaneo o alle reazioni allergeniche a un antigene. Simile ad altre vie, anche la soluzione intradermica deve essere preparata utilizzando la tecnica sterile. E deve essere fisiologicamente tamponato per avere un pH neutro al fine di evitare la necrosi tissutale nel sito di iniezione. Per questa iniezione viene spesso utilizzato un sistema senza mozzo con un ago calibro 25-30. Questo sistema aiuta a preservare il volume di somministrazione, che è nell'intervallo di 50-100 microlitri per sito di iniezione. L'iniezione in eccesso può causare necrosi o perdite di composti indesiderati a causa della pressione.
La via intranasale è spesso scelta per la somministrazione locale di vaccinazioni o spray decongestionante, nonché per la somministrazione sistemica e del SNC. La mucosa che riveste la cavità nasale ha un ricco apporto di vasi sanguigni e nervi che consentono un rapido assorbimento sistemico e un targeting diretto al SNC. Questo è un metodo non invasivo che richiede una formazione e un'abilità minime e attrezzature semplici: una micropipetta calibrata e alcune punte usa e getta. I volumi di somministrazione per i ratti non devono superare i 40-100 microlitri somministrati in 6-10 microlitri-gocce. E per i topi, il volume totale massimo è di 24 microlitri dati in 3-4 microlitri-gocce.
Sebbene l'anestesia non sia richiesta per questa procedura, presenta alcuni vantaggi rispetto alla somministrazione intranasale in animali coscienti 1) facilita il corretto posizionamento del composto alle narici, garantendo un dosaggio accurato 2) elimina la possibilità che l'animale morda l'apparecchiatura di dosaggio 3) assicura che non vi siano lesioni al tessuto nasale dell'animale, agli occhi, o pelle del viso a causa di scatti della testa, e 4) l'animale ha meno probabilità di sbuffare e spruzzare il composto dalle narici al momento della somministrazione.
Le iniezioni intracranici in topi e ratti adulti impiegano l'uso di apparecchiature stereotassica, che è descritto in un video nella raccolta "Essentials of Neuroscience". L'apparecchiatura assicura un corretto posizionamento e una corretta profondità di iniezione. Qui, ci concentreremo sulla consegna intracranica in topi e ratti neonatali in cui il cranio è abbastanza sottile da iniettare direttamente attraverso di esso e potrebbe essere troppo fragile per supportare il dispositivo stereotassico. Gli scopi principali di questa tecnica sono di fornire agenti farmacologici del SNC direttamente nel SNC e di evitare gli effetti incontrati attraverso qualsiasi via sistemica. Il calibro dell'ago, la lunghezza e il volume di somministrazione sono determinati in base alla specie e all'età dei cuccioli. Si noti che all'aumentare dell'età dell'animale, il numero di indicatori diminuisce, aumenta la lunghezza dell'ago richiesta e aumenta anche il volume massimo di somministrazione raccomandato.
Con queste informazioni di base in mente, approfondiamo le procedure di questi metodi di iniezione. Il primo è la tecnica di somministrazione intradermica. Questa procedura deve essere eseguita in animali anestetizzati. Esamina un altro video in questa raccolta per comprendere le procedure per l'induzione e la manutenzione dell'anestesia.
Una volta che l'animale è anestetizzato, radere il sito di iniezione usando un rasoio elettrico o una crema depilatoria. Con una garza inuminata dall'acqua, rimuovere accuratamente i capelli persistenti dal sito. Quindi, con un altro tampone di garza, applicare una soluzione antisettica topica all'area rasata. Per la somministrazione, stabilizzare prima la pelle nel sito di iniezione allungandola tra il pollice e l'indice.
Ora posiziona la smussatura dell'ago sulla pelle e inseriscila delicatamente appena oltre la smussatura in modo che l'apertura sia tra l'epidermide e gli strati del derma. Quindi iniettare lentamente e notare che crea un bleb nella pelle. Se l'ago viene inserito troppo in profondità, non si formerà alcun bleb. Dopo l'iniezione, fare una pausa per consentire alla pelle di allungarsi e regolarsi, quindi ritirare lentamente l'ago. Non tirare indietro lo stantuffo in qualsiasi momento, poiché si estrarrebbe il tessuto e causerebbe traumi nel sito di iniezione. Inoltre, non pulire o asciugare il sito di iniezione, in quanto ciò potrebbe causare la fuoriuscita della sostanza iniettata. Quando si eseguono iniezioni multiple, assicurarsi di distanziarli abbastanza ampiamente in modo che i bleb non si sovrappongano l'uno con l'altro.
Successivamente, impariamo la procedura di somministrazione intranasale in animali coscienti e anestetizzati.
Per gli animali svegli, trattenerli scruffando la pelle alla nuca e quindi tenere l'animale in posizione verticale con la testa immobilizzata. Fai attenzione a non restringere il torace in quanto ciò potrebbe impedire la capacità dell'animale di fare respiri sufficientemente profondi per attirare il liquido nei polmoni. Utilizzando una micropipetta, somministrare parte della soluzione posizionando una piccola goccia di liquido all'apertura nasale. L'animale inalerà la goccia. Ripetere questo processo, alternando tra le due aperture nasali fino a quando non è stato dato l'intero volume da somministrare. Richiamo: il volume totale di somministrazione non deve superare i 24 μl e i 100 μl rispettivamente nei topi e nei ratti.
Per topi e ratti anestetizzati, posizionare l'animale in una posizione di reclinazione dorsale. Questa posizione è ideale per la consegna del SNC in quanto consente un migliore assorbimento del composto. Ruotare la testa dell'animale e somministrare metà del composto direttamente in un lato dell'apertura nasale, cronometrandolo con l'inalazione. Quindi, ruotare la testa dell'animale in posizione per la prossima somministrazione. Dopo circa 2 respiri, somministrare il volume rimanente nella seconda apertura nasale. Dopo la somministrazione completa, riportare l'animale nella sua gabbia.
Successivamente, esaminiamo la procedura di somministrazione intracranica per topi e ratti neonatali. Prima di iniziare la procedura, posizionare la gabbia con i cuccioli e la diga su una piastra riscaldante elettrica impostata su bassa. Assicurarsi che una parte della gabbia sia fuori dalla piastra riscaldante. Questo per prevenire l'ipotermia e, allo stesso tempo, consentire alla diga di allontanarsi dal calore se lo desidera. Quindi, selezionare un misuratore dell'ago appropriato per l'età dell'animale. Richiamo, l'indicatore dell'ago; lunghezza dell'ago, che viene utilizzata per controllare la profondità dell'ago durante l'iniezione intracranica; e il volume di amministrazione... tutti variano a seconda dell'età e della specie dell'animale.
La lunghezza viene regolata utilizzando una protezione. Per preparare questa guardia, misurare l'ago corretto contro il suo cappuccio e lasciare un segno. Quindi, posiziona un secondo segno sul cappuccio per indicare dove verrà tagliato. La distanza tra i due segni è la lunghezza dell'ago desiderata. Quindi, tagliare il cappuccio con una lama di rasoio. Non usare le forbici in quanto schiacceranno il tappo e non produrranno un taglio pulito. Questa è la "protezione dell'ago". Smaltire l'ago utilizzato per creare la protezione, in quanto non è più sterile, e inserire invece un nuovo ago nella protezione e assicurarsi che la lunghezza corretta sia esposta. Quindi, utilizzando un ago diverso attaccato alla siringa adatta, estrarre la sostanza iniettabile. Per fare questo viene utilizzato un ago diverso, perché il posizionamento nel tappo opacizzerà significativamente questi aghi sottili, il che non è l'ideale per la somministrazione intracranica. Quindi, posizionare la siringa piena sull'ago con la protezione. Ora il sistema è pronto per un'iniezione.
Per i cuccioli di età superiore ai 10 giorni, somministrare l'anestesia per inalazione. I cuccioli di età inferiore ai 10 giorni non devono essere anestetizzati. Per eseguire l'iniezione, individuare prima il sito, che si trova a 5 mm dietro l'occhio e a circa 3 mm dalla linea mediana del cranio. Quindi, inserire l'ago alla profondità consentita dalla protezione dell'ago. Quindi, iniettare in modo lento e costante per evitare traumi al cervello. Rimuovere l'ago immediatamente e con grande cura per prevenire lesioni al tessuto cerebrale. Infine, rimettete l'animale con la diga per consentire un corretto recupero.
Ora esaminiamo alcuni esperimenti condotti oggi nei laboratori che utilizzano queste vie di somministrazione non comuni.
Un'iniezione intradermica viene spesso utilizzata per studiare la reazione infiammatoria cutanea. In questo esperimento, i ricercatori hanno utilizzato questo metodo per iniettare un allergene in un orecchio e una sostanza neutra nell'orecchio opposto di un topo pre-sensibilizzato. Successivamente, hanno consegnato un colorante blu nel sistema circolatorio dell'animale per esaminare i cambiamenti nella permeabilità vascolare dovuti all'iniezione di allergeni.
Come accennato in precedenza, una delle applicazioni della somministrazione intranasale è quella di somministrare vaccini. Qui, gli scienziati hanno utilizzato questa via per fornire un vaccino antinfluenzale vivo attenuato geneticamente modificato nei topi selvatici e transgenici e hanno studiato l'immunità della mucosa attraverso la produzione di un tipo specifico di cellule T.
Infine, queste ricerche biomediche hanno utilizzato la somministrazione intracranica per impiantare cellule tumorali in topi immunocompromessi, al fine di creare un modello di tumore al cervello umano. L'efficacia dell'iniezione è stata quindi analizzata utilizzando un sistema di imaging in vivo.
Hai guardato il video di JoVE su alcuni dei metodi speciali di somministrazione di composti in topi e ratti di laboratorio. Ora dovresti capire quando queste procedure sono utili, le considerazioni che dovresti tenere a mente prima e durante l'esecuzione di queste tecniche e le fasi procedurali essenziali per garantire che la somministrazione abbia un impatto minimo sulla salute dell'animale e sui dati sperimentali da raccogliere. Come sempre, grazie per aver guardato!
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Applications and Summary
La somministrazione di composti negli animali può avere un effetto significativo sia sul benessere dell'animale che sull'esito dei dati sperimentali e sul valore scientifico. Il corretto metodo di consegna è essenziale per il successo dell'esperimento. Molti fattori devono essere considerati per determinare la via migliore, tra cui l'obiettivo scientifico dello studio, il pH della sostanza, il volume di dosaggio richiesto, la viscosità della sostanza e il benessere degli animali. La competenza tecnica è anche un requisito per tutti i metodi di iniezione.
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