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Organic Chemistry
 

Chromatographie sur colonne

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Chromatographie sur colonne est une méthode de purification polyvalent utilisée pour séparer les composés présents dans une solution. Un mélange de solution est porté par un solvant à travers une colonne contenant un adsorbant solide, appelé la phase stationnaire. Le mélange de solvant et l’échantillon est appelé la phase mobile.

Molécules dans la phase mobile voyagent à travers la colonne à des vitesses différentes, basé sur leurs propriétés chimiques et leur affinité pour la phase stationnaire. Ainsi, chaque composé quitte la colonne à un autre moment. Une fois que les composés ont été séparées et purifiées, elles peuvent être traitées ultérieurement ou sont prêts à être distribué. Cette vidéo va mettre en place les bases de la chromatographie sur colonne, puis démontrer la technique avec la purification de composés organiques.

En chromatographie sur colonne, molécules s’adsorbent réversible à la phase stationnaire comme ils traversent la colonne, ce qui ralentit leur progression. Les composés interagissant faiblement avec la phase stationnaire sont plus rapides à la sortie de la colonne, ou éluer. Composés qui interagissent fortement avec la phase stationnaire sont plus lents à éluer. La phase stationnaire est un adsorbant poudre ou gel tels que le gel de silice ou alumine. Gel de silice et d’alumine sont très polaires afin qu’ils interagissent fortement avec des solvants et de composés polaires et faiblement molécules non polaires. La phase stationnaire est chargée dans la colonne comme une bouillie avec le solvant et est ensuite emballée par coulant solvant à travers la phase stationnaire. Lorsqu’elles sont correctement emballées, la phase stationnaire est homogène de haut en bas et contient aucune bulle d’air ou des plaques sèches, comme inégale flux causée par ces irrégularités interfère avec la séparation des composés. Le solvant, ou comme éluant, est typiquement un solvant organique provenant d’un réservoir. En général, les solvants non polaires éluer seulement composés non polaires, considérant que les solvants polaires éluer les composés polaires et non polaires. Si un mélange contient des composés de polarité différente, une série de solvants de plus en plus polaires peut servir à éluer tous les composés d’intérêt. Le débit de la phase mobile est généralement contrôlé par un robinet en bas de la colonne. Pauses du débit sont gardés à un minimum afin d’éviter la diffusion des composés. La phase mobile quittant la colonne, appelée l’éluat, est recueillie dans les fractions de préserver la séparation des composés. Maintenant que vous comprenez les principes de la chromatographie sur colonne, Let ' s go grâce à une procédure pour la purification d’un mélange de composés organiques.

Pour commencer la procédure, obtenir l’équipement tel que mentionné dans le texte. Peser un ballon à fond rond pour chacun des composés isolés et enregistrer la masse. Ensuite, peser l’échantillon et le dissoudre dans le volume minimal de solvant nécessaire. Le solvant approprié devrait être prédéterminé à l’aide de la chromatographie sur couche mince. La valeur de Rf doit être entre 0,2 et 0,3. Ensuite, déterminer la quantité de gel de silice requis pour la phase stationnaire, basée sur le poids sec de l’échantillon et la différence de distance de migration des composés d’intérêt basé sur la présélection de TLC. Versez la quantité appropriée de gel de silice dans un erlenmeyer. Ajouter le solvant pour le gel de silice, jusqu'à ce que la boue est translucide et se déplace librement quand le ballon est tourbillonnait. Ensuite, sélectionnez une colonne assez grande pour que le gel de silice il comblera à mi-chemin. Si la colonne ne possède pas de fritte de verre, placer la laine de verre dans la colonne et pressez-le fermement vers le bas avec une longue tige. Couvrir la laine de verre avec environ 2 cm de sable pour empêcher l’en passant par la laine de verre de silice. Sous une hotte fixer la colonne à un support de bague, permettant un espace suffisant ci-dessous pour accueillir les tubes à essai.

Placez un entonnoir dans la colonne, puis assurez-vous que le robinet est fermé. Verser la pâte dans la colonne, tapotant doucement les parties que la boue s’installe pour exclure les bulles d’air. Rincer l’entonnoir, fiole et parois de la colonne avec le solvant de transférer la totalité du gel dans la colonne.

Placez un erlenmeyer sous la colonne. Ouvrir le robinet et laisser le solvant s’écouler dans le ballon jusqu'à ce que le niveau de solvant est juste au dessus du gel de silice et puis fermez le robinet d’arrêt. Versez environ 2 cm de sable sur le gel. Rincer doucement vers le bas de n’importe quel sable collé sur les côtés de la colonne avec le solvant. Égoutter le solvant au besoin si le sable est le plus souvent sec, mais la silice reste entièrement recouvert.

Pour démarrer la séparation, ajouter l’échantillon à la colonne sans déranger le sable. Utiliser des petites portions de solvant pour rincer à n’importe quel échantillon adhèrent aux parois colonne et pour rincer le récipient à échantillon. Soutirer avec précaution le solvant jusqu'à ce que le niveau est juste au-dessus de la silice. Puis, avec une pipette, ajouter doucement 4 – 5 mL de solvant sans déranger la couche de sable. Placez un entonnoir dans la colonne et remplir lentement avec le solvant. Enlever le ballon et le remplacer par un tube à essai marqué. Avec le premier tube à essai en place, ouvrir le robinet et recueillir l’éluat jusqu'à ce que le tube est presque plein.

Poursuivre la collecte de fractions jusqu'à ce que tous les composés désirés ont été éluées, procéder dans l’ordre à travers les tubes à essai marqués. Lorsque vous avez terminé, fermez le robinet d’arrêt.

Pour chacun des composés isolés, combiner les fractions pures dans un ballon à fond rond préalablement pesé. Éliminer le solvant de la fiole sur un évaporateur rotatif et peser le ballon à fond rond contenant le composé sec. Pour plus d’informations, voir la vidéo de cette collection sur l’évaporateur rotatif.

Cet exemple contenue un mélange de tétraphénylporphyrine, ou PPT et fluorénone. Le PPT de pourpre rougeâtre foncé est élué tout d’abord, suivie de la fluorénone jaune. La pureté de chaque composé isolé a été confirmée par spectroscopie RMN.

Chromatographie sur colonne est utilisé dans la purification et l’analyse dans une variété de domaines scientifiques.

Chromatographie liquide haute performance ou HPLC, est une forme de chromatographie sur colonne qui fournit l’excellente séparation entre les composés et peut intégrer des détecteurs spécialisés comme un détecteur de rayonnement pour les molécules radiomarquées. Par CLHP, un phospholipide radioactif peut facilement être isolé à partir d’un mélange de beaucoup d’autres même si elle représente un faible pourcentage du mélange. Cette information peut aider à élucider la production, réglementation et aux fonctions de nombreuses biomolécules importantes.

Chromatographie flash est une variante de la chromatographie sur colonne, dans laquelle la phase mobile se déplace à travers la colonne sous la pression d’air ou de gaz, plutôt que par le seul écoulement par gravité.

Cela crée un débit plus rapide, réduisant au minimum de diffusion pour une meilleure séparation. Le composé désiré est recueilli en quelques fractions de pures et concentrées, comme indiqué par chromatographie sur couche mince, résultant dans la pureté et l’excellent rendement après la purification.

L’appareil habituel de colonne n’est pas approprié pour séparer les petits volumes, mais certains mélanges ne sont pas compatibles avec des techniques spécialisées telles que l’HPLC. Purification à petite échelle est effectuée avec des colonnes de pipette de verre, avec une ampoule de pipette utilisée pour chromatographie flash à petite échelle. Ceci est particulièrement utile lors de la préparation d’un échantillon de techniques de purification spécialisés ou comme une étape finale après purification à grande échelle.

Vous avez juste regardé introduction de Jupiter à la chromatographie sur colonne. Vous devez maintenant être familiarisé avec les principes de la chromatographie sur colonne, une procédure pour chromatographie sur colonne de gel de silice et certaines applications de la technique.

Merci de regarder !

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