Retirada de Sangue I

Antes do procedimento de sangramento, o tipo de amostra necessária deve ser determinado. Procedimentos experimentais podem exigir sangue inteiro, plasma ou soro. Para o sangue inteiro, um anticoagulante deve ser adicionado à amostra. O plasma, que contém fibrinogênio e outros fatores de coagulação quando separados dos glóbulos vermelhos, pode ser extraído de uma amostra anticoagulada. O soro é obtido através da coleta de sangue sem um anticoagulante. O soro resultará da centrifugação da amostra uma vez que um coágulo tenha se formado. Como a amostra coagula, o soro não conterá fibrinogênio ou outros fatores de coagulação. Tanto o plasma quanto o soro são obtidos através do uso de uma centrífuga a 2200-2500 RPM por um mínimo de 15 minutos.

Para uma amostra que deve produzir sangue inteiro ou plasma, deve-se usar um anticoagulante apropriado. Anticoagulantes comumente usados para animais de laboratório são heparina, citrato de sódio e ácido tetraáctico de etilenodiamina (EDTA); seleção da qual é baseada em necessidades de pesquisa. Sequester-uma forma líquida de EDTA, heparina e citrato de sódio pode ser carregado diretamente na seringa para revestir as superfícies. Isso permite o contato do anticoagulante diretamente à medida que o sangue é extraído, auxiliando na prevenção da coagulação. Como o sangue de rato coagula mais rápido do que a maioria do sangue mamífero, é essencial que a razão correta de anticoagulante para sangue seja usada para coleta de sangue.

A seleção da agulha é baseada no tamanho do animal e no local da venipunctura. Em geral, quanto maior o furo da agulha, mais rapidamente a amostra pode ser coletada. Menos danos às células sanguíneas é outro benefício para agulhas maiores. No entanto, a principal desvantagem para agulhas de grande porte é o dano potencial ao vaso. Em camundongos e ratos, as opções de tamanho variam de agulhas de calibre 20-29 que têm 0,5-1,5 polegadas de comprimento. Se uma agulha é muito longa, não só é estranho usar, mas ter o espaço extra na agulha pode resultar em coagulação. O tamanho adequado da agulha está listado para cada método na seção de procedimentos.

O tamanho da amostra necessária também deve ser predeterminado. Devido ao pequeno tamanho do rato ou rato, a quantidade máxima de coleta de sangue deve ser calculada para um sangramento de sobrevivência. Um rato médio pesando 25 gramas tem um volume sanguíneo total de 1,8 ml; o rato médio pesando 250 gramas tem um volume sanguíneo total de 16 ml. Para uma única amostra de sangue em um rato ou rato sem substituição de fluido, o volume máximo de sangue que pode ser removido com segurança é de 10% do volume sanguíneo total, ou 7,7-8 μl/g. Assim, para um rato médio, 10% do seu volume sanguíneo é de 193-200 μl. Para um rato médio de 250 gramas, isso equivale a 1,9-2,0 ml. Estudos mostraram que remover mais de 15% do volume sanguíneo pode causar choque hipovolêmico. ^1,2 No entanto, com a substituição do fluido, até 15% do volume total do sangue ou 12 μl/g-podem ser removidos. Para um mouse de 25 gramas, isso equivale a 300 μl; para um rato de 250 gramas, é equivalente a 3 ml. Para a substituição do fluido, os fluidos devem ser aquecidos e dados subcutâneamente.

Se for necessário colher várias amostras, o volume sanguíneo extraído é reduzido. O volume máximo de sangue que pode ser extraído por semana não é superior a 7,5% do volume sanguíneo total, ou 6 μl/g. Para um mouse de 25 gramas, isso equivale a 145-150 μl por semana. Para um rato de 250 gramas, isso equivale a 1,45-1,50 ml por semana. Se a amostragem ocorrer a cada 2 semanas, até 10% do volume sanguíneo total (8 μl/g) poderá ser sorteado. Isso equivale a 200 μl a cada 2 semanas para um rato médio, e até 2,00 ml a cada 2 semanas para um rato de 250 gramas. Um estudo, realizado em ratos com o peso médio de 250 gramas, revelou que quando os volumes sanguíneos de 15-20% foram removidos, levou mais de 29 dias para que os níveis sanguíneos se normalizassem. ^1,2 Para a coleta de sangue repetida, a substituição do fluido não permite um maior volume sanguíneo ou coleta de sangue mais frequente, pois substitui apenas o volume. O animal precisará de tempo para repor as células sanguíneas.

O uso do plexo retro-orbital tem sido uma prática comum no passado. No entanto, muitas preocupações sobre a humanidade desse procedimento surgiram. Durante o procedimento, o movimento excessivo do tubo hematócrito uma vez colocado no canthus medial do olho pode causar danos aos tecidos circundantes, resultando em inchaço das pálpebras e/ou membranas conjuntivistas. Os tecidos inchados podem fazer com que o globo ocular se projeta o suficiente para que o fechamento da pálpebra seja impedido, resultando potencialmente em secagem e danos na córnea. Dor do inchaço pode desencadear arranhões e automutilação que resulta em enucleação do olho. A colocação inadequada do tubo hematócrito durante uma hemorragia retro-orbital pode cortar o nervo óptico, resultando em cegueira. Se o tubo hematócrito for avançado em um ângulo impróprio, o olho pode ser forçado a sair da órbita, permitindo que as pálpebras caiam atrás do globo ocular. Se isso ocorrer, é muito difícil substituir corretamente o olho na tomada. Outras questões que podem surgir incluem fratura dos frágeis ossos da órbita, penetração do globo ocular que resulta na perda de humor vítreo, ou a formação de um hematoma atrás do olho que pode resultar em dor extrema devido à pressão no olho e estruturas circundantes. Apesar de todas essas preocupações, se um técnico qualificado realiza o procedimento e o animal é totalmente anestesiado com um anestésico geral, como a anestesia ininhante isoflurane, o sangramento retro-orbital tem se mostrado um método eficaz de coleta de sangue em roedores.

A estrutura anatômica da área orbital é diferente entre o rato e o rato. O rato tem o sinuso retro-orbital- uma coleção de vasos que criam um seio na área orbital. Na órbita do olho de rato, há um plexo de vasos que fluem atrás desse olho; no entanto, eles não formam um seio, como no rato. Consequentemente, é mais fácil realizar este procedimento em camundongos. Para a coleta de amostragem repetida através do plexo retro-orbital, é necessário um mínimo de 10 dias entre os sangramentos para permitir que os tecidos da área se curem. Embora a anestesia geral seja recomendada, o procedimento pode ser realizado em camundongos sem anestesia geral se um anestésico oftalmológico tópico, como proparaca ou tetracaína, for aplicado antes do procedimento. Como os ratos não têm o seio retro-orbital, e como suas membranas ao redor da órbita são muito mais fortes, é obrigatório anestesiar-los para este procedimento.

Amostras seriais de um pequeno volume podem ser obtidas usando um método de clipe de cauda. A amputação inicial da cauda deve ser limitada a uma ponta traseira, aproximadamente 0,5-1,0 mm de comprimento em camundongos e 2,0 mm em ratos. ¹ O procedimento de corte de cauda para coleta de sangue permite coletas em série interrompendo a cicatriz ou coágulo do corte original na extremidade da cauda. Geralmente, não é necessária amputação adicional da ponta da cauda. Os volumes de sangue coletados variam de 20-100 μL para camundongos e 75-150 μL para ratos. A quantidade coletada é variável entre os animais e pode ser influenciada pela idade, estado de saúde e peso.

A amostra coletada de um corte de cauda pode conter sangue arterial e venoso, juntamente com contaminação do produto tecidual. A qualidade da amostra diminui se a cauda for acariciada ou "ordenhada" para obter mais sangue. Para aumentar o fluxo sanguíneo, a cauda pode ser aquecida com compressas quentes, uma lâmpada de calor ou submersão em água morna. A pressão deve ser aplicada na ponta da cauda para hemostasia, e os animais devem ser verificados a cada 5-10 minutos para garantir que a hemostasia tenha sido alcançada. A hemostasia é frequentemente retardada com amostragem repetida. Um pó esticado pode ser usado para hemostasia. Para a amputação inicial, recomenda-se anestesia (geral ou local). O sangramento subsequente não deve exigir anestesia, especialmente porque os animais se habituam ao procedimento. A anestesia causará uma queda na pressão arterial, dificultando a coleta de sangue com essa técnica.

Uma alternativa para um corte de cauda é o corte do vaso de cauda. Este procedimento é facilmente realizado em camundongos e ratos. No entanto, como com o corte da cauda, as amostras podem estar contaminadas com produtos tecidos, especialmente no camundongo. Para ratos, uma agulha hipodérmica é inserida no vaso, e o sangue é coletado do centro da agulha. Um estudo demonstrou o uso de um torniquete colocado acima do local de punção da agulha para auxiliar na coleta de sangue. ³ Uma seringa não é usada para tirar o sangue do vaso, pois a pressão criada a partir da seringa vai colapsar o vaso. Este método também pode ser usado para amostragem serial, pois um coágulo pode ser removido para fazer com que o local sangre novamente. Assim como nos cortes de cauda, é imprescindível garantir a hemostasia aplicando pressão no local e rechecando o animal a cada 5-10 minutos.

Muitas vezes, os estudos requerem uma amostra de sangue não-sutaracival, grande que é coletada através de exsanguinação através de um sangramento intracardiac ou da veia cava caudal. ⁴ Aproximadamente metade do volume sanguíneo total pode ser coletado de um rato ou rato por punção cardíaca. Isso equivale a 40 μl/g ou aproximadamente 1 ml para um mouse médio de 25 gramas. Um rato de 250 gramas produziria aproximadamente 10 ml de sangue. O animal deve ser anestesiado para exsanguinação. A anestesia inalante ou narcose_co2 pode ser usada por um técnico proficiente; anestesia injetável também pode ser usada. No entanto, pode haver uma diminuição da pressão arterial e da circulação, o que pode diminuir a quantidade de sangue coletada.

O método caudal vena cava exige que o animal seja profundamente anestesiado para expor cirurgicamente o vaso. A narcose co₂ não é suficiente, pois o coração deve estar batendo e o animal respirando durante a retirada de sangue. Durante o procedimento, a retirada muito rápida do sangue pode fazer com que o vaso entre em colapso no chanfrado da seringa, ocluindo a abertura e impedindo a coleta de sangue. Além disso, as paredes do vaso são finas e, portanto, o movimento da mão e da agulha deve ser evitado para evitar ruptura ou vazamento de sangue do local de entrada da agulha. Como a agulha não está passando pela pele, este método resulta na coleta de uma amostra estéril. Métodos aditivos de eutanásia devem ser empregados para garantir que o animal não se recupere da anestesia. Este método é frequentemente seguido por perfusão cardíaca ou aórtica.

O método intracardiac pode ser realizado tanto com o animal contido manualmente uma vez que é anestesiado (método fechado), ou o coração pode ser exposto cirurgicamente de acordo com o protocolo para o método de coleta de sangue vena cava caudal (método aberto). Para o método fechado, os marcos para colocação da agulha são o sulco formado pela caixa torácica no processo xifoide, no lado esquerdo do animal.

1. Sangramento retro-orbital

1. Equipamento
   1. Prepare um frasco de sino, ou câmara de indução anestésico, para administrar um gás anestésico como isoflurano. Ao usar um frasco de sino, é imprescindível que o anestésico líquido não entre em contato com o animal, para evitar a absorção através da pele. Uma plataforma com pequenos buracos pode ser usada.
   2. São preferidos tubos de microhematocrito que possuem 50-75 microliters. Os tubos embrulhados mylar são menos propensos a quebrar entre os dedos do operador e devem ser considerados como uma medida de segurança.
   3. Várias espessuras de papel toalha, ou outros materiais isolantes, são colocadas na superfície de trabalho para manter o calor corporal do animal durante o procedimento.
2. Preparação e posicionamento do animal
   1. O animal é anestesiado com um anestésico de inalação, como isoflurano, em um frasco de sino ou câmara de indução de anestesia a gás, para efeito.
   2. Uma vez que o animal é totalmente anestesiado, ele é removido e colocado em recumedência lateral.
   3. O olho é salientes colocando um dedo na parte superior da cabeça e ao longo da mandíbula, e puxando a pele para trás e para baixo.
   4. Evite aplicar pressão na traqueia, pois isso pode entrar em colapso ou ocluir as vias aéreas causando a morte por asfixia.
3. Retirada de sangue
   1. O microhematocrit é colocado no canthus medial do olho e direcionado caudally a um ângulo de 30-45° do plano do nariz.
   2. Aplique pressão enquanto gira suavemente o tubo hematócrito. Isso cortará as membranas conjuntivistas e romperá o plexo ocular.
   3. O sangue fluirá para o tubo hematócrito por ação capilar.
   4. Evite empurrar tão fundo que você atingiu o osso na parte de trás da cavidade ocular.
   5. Uma vez que o sangue começa a fluir, mantenha a pressão para manter o olho salientes.
   6. Para coletar vários tubos de sangue, não é necessário colocar o próximo tubo no plexo ocular, pois o sangue continuará a fluir e pode ser coletado como vem do canthus medial.
   7. Para parar de sangrar, solte a pele e deixe o olho voltar à posição normal. Aplique pressão na órbita para garantir hemostasia.

Figura 1. Retirada de sangue orbital retrô em camundongos.

2. Procedimentos de sangramento na cauda: corte de cauda e corte de cauda

1. Equipamento
   1. Uma lâmina de bisturi estéril, de preferência uma lâmina número 11 ou uma lâmina de barbear de um lado único, é usada para fazer a amputação inicial para o método de corte de cauda. A tesoura não deve ser utilizada porque o corte feito por tesoura é esmagamento, promovendo assim a coagulação e a redução do fluxo sanguíneo. Para o procedimento de corte da cauda, uma lâmina de bisturi número 11 ou 15 é usada para fazer o corte.
   2. Um tubo de contenção que permite o acesso à cauda do mouse é preparado.
   3. Toalhas de papel absorvente ou gaze são usadas como substrato para a realização do corte de cauda.
   4. Também são necessários tubos de coleta ou tubos hematócritos.
   5. O pó esticado deve estar disponível para auxiliar na hemostasia.
2. Restrição
   1. O animal é colocado no tubo de tal forma que a cauda é acessível. Para os contê-inérculos do tipo Broome, o animal é puxado garupa primeiro para dentro do tubo. Para outros tubos, o animal é colocado de cabeça.
   2. Os animais são fixados no tubo de tal forma que não podem se virar ou retirar a cauda.
   3. Alguns camundongos permitirão a coleta de cauda e sangue com mínima contenção manual se eles forem autorizados a pegar uma superfície áspera.
   4. Alguns ratos exigirão anestesia por inalação para este método de coleta de sangue.
3. Retirada de sangue
   1. A cauda é limpa com água morna para remover detritos e causar leve vasodilatação. NÃO use água quente.
   2. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e a extremidade da cauda (0,5-1 mm para ratos e até 2 mm para ratos) é cortada com a lâmina do bisturi.
   3. Para o corte da cauda, a cauda é estendida, e um corte é feito com a lâmina do bisturi aproximadamente 2/3 a distância da garupa, diretamente sobre a veia traseira lateral.
   4. A cauda pode ser acariciada de garupa para ponta para incentivar o fluxo sanguíneo; no entanto, isso diminuirá a qualidade da amostra.
   5. O sangue é coletado da ponta ou corte usando tubos hematócritos ou permitido pingar em um frasco de coleta.

3. Coleta de sangue cardíaco

1. Equipamento
   1. Para um rato, é preferível uma seringa de 3 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1". Seringas menores não têm a mesma pressão nas costas e podem dificultar a retirada de sangue. Agulhas menores que 25 medidores restringem o fluxo de sangue, levando ao aumento da coagulação e danos às células sanguíneas. Agulhas menores que 1" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
   2. Para um rato, é preferível uma seringa de 10-12 cc com uma agulha de calibre x 1,5". Dependendo do tamanho do rato, uma seringa menor pode não conter todo o volume sanguíneo a ser coletado, e assim a seringa teria que ser alterada durante o procedimento. Agulhas menores que 20 medidores restringem o fluxo do sangue, levando ao aumento da coagulação. Agulhas menores que 1,5" podem não atingir o nível do coração quando se aproximam do diafragma.
   3. Um tubo de coleta de sangue de tamanho suficiente é usado para manter o sangue coletado.
2. Restrição
   1. A contenção adequada é essencial para o sucesso deste método. O animal é segurado pelo scruff com o corpo pendurado verticalmente. É importante que o corpo seja reto para evitar a deflexão do coração ou uma torção do peito.
   2. Uma posição alternativa é a recumbência dorsal ao colocar a agulha entre as costelas do lado esquerdo do animal. Isso é especialmente útil para ratos muito grandes ou quando vários animais devem ser sangrados.

Figura 2. Retirada de sangue cardíaco com rato mantido verticalmente.

3. Retirada de sangue
   1. A abordagem do aspecto posterior, pontuando o diafragma é mais facilmente realizada quando o rato ou rato é mantido verticalmente pelo scruff.
      1. A agulha é avançada no entalhe apenas à esquerda do xiphoide do animal.
      2. A agulha deve ser paralela à coluna vertebral e colocada logo abaixo das costelas.
      3. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
      4. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
      5. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
      6. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional nas costas na seringa.
   2. A abordagem lateral do lado esquerdo do animal requer o posicionamento do animal na recumbência dorsal.
      1. O ponto de entrada é medido contra o ponto do cotovelo na parede do peito. O coração está localizado aproximadamente ao nível do cotovelo.
      2. A agulha é inserida perpendicular ao plano da mesa em um ponto no meio da parede do peito como medido dorsoventrally.
      3. Coloque a agulha, bisbida, no peito, e perfure o coração.
      4. Aplique uma leve pressão nas costas com a seringa. Se a agulha estiver no coração, o sangue fluirá para dentro da seringa.
      5. Espere até que o sangue tenha enchido a seringa antes de adicionar pressão adicional na seringa.

Figura 3. Retirada de sangue cardíaco com rato em posição de recumbência dorsal.

4. Dicas técnicas
   1. O coração normal está situado com o ápice apontando para a esquerda. Em raros casos, o coração pode ser invertido, resultando em dificuldade em perfurar o coração.
   2. A pressão excessiva nas costas na seringa pode colapsar o coração, ocluindo o bisel da agulha e impedindo o fluxo sanguíneo para dentro da seringa.
   3. Aplicar pressão traseira e liberá-la repetidamente iniciará a coagulação na seringa.
   4. Aplicar suavemente pressão no fígado pode forçar o volume sanguíneo adicional para o sistema circulatório, tornando-o disponível para retirada.

4. Retirada posterior de sangue vena cava

4. Equipamento
   1. Uma seringa de tuberculose com uma agulha calibre 25-29 é usada para coleta de sangue no camundongo. Para ratos, é necessária uma seringa de 10-12 cc com uma agulha calibre 22-25 x 1".
   2. Uma plataforma cirúrgica, bandeja de dissecção ou outra superfície para proteger o animal são necessárias, juntamente com laços, fita ou pinos para afixar os membros em posição.
   3. A anestesia injetável ou a anestesia da inalação é necessária. Se usar anestesia de inalação, é desejável que o anestésico seja entregue através de um vaporizador de precisão com um cone de nariz. O comprimento do procedimento é tal que o uso de uma câmara de indução sem entrega adicional de gás anestésico não fornecerá tempo suficiente para completar a retirada de sangue antes que o animal reaviva.
   4. São necessárias tesouras de íris para o rato, ou uma tesoura afiada para o rato, juntamente com pequenas fórceps atraumáticas do polegar e uma esponja de gaze de 2"x 2".
5. Restrição
   1. Quando o animal é totalmente anestesiado, determinado por pinça do dedo do dedo ou beliscão da cauda, o animal é colocado em recumbência dorsal.
   2. Os membros são fixados na plataforma com fita ou pinos. Os membros devem ser estendidos para longe do corpo.
6. Retirada
   1. A pele é levantada e um pequeno corte transverso é feito através da pele logo acima da pelve em fêmeas, ou logo acima do prepuce em machos.
   2. O ponto da tesoura é colocado no corte, e uma incisão midline é feita através da pele da pelve/prepuce para o xifoide.
   3. A pele é refletida lateralmente para cada lado. Dissecção contundente pode ser necessária para soltá-lo do músculo subjacente.
   4. O músculo é levantado, e um pequeno corte transverso é feito através do músculo logo acima do corte da pele.
   5. O ponto da tesoura é colocado no abdômen e uma incisão média é feita através do músculo para o xiphoide. Certifique-se de inclinar o ponto da tesoura para cima para evitar o corte de quaisquer órgãos.
   6. Corte transversalmente ao longo da curva das costelas de cada lado. Tenha cuidado extra para não perfurar o fígado.
   7. Mova suavemente os intestinos para a esquerda do animal para expor a veia cava posterior.
   8. Coloque uma almofada de gaze no fígado, e descanse o índice e o dedo médio no fígado.
   9. Por outro lado, insira a agulha, bivele para cima, na veia cava no meio do caminho entre a junção dos vasos renais e a bifurcação ilícíaca.
   10. Retire lentamente o sangue enquanto aplica pressão no fígado.

Figura 4. Retirada de sangue da veia cava posterior.

A coleta de sangue para ratos e ratos pode ser realizada com uma variedade de técnicas. Embora muitos fatores, como tamanho amostral, frequência de amostragem e o tamanho e idade do animal influenciem isso, o componente mais essencial é o nível de habilidade do técnico que realiza a coleta amostral. Para os métodos aqui descritos, o uso adequado de anestésicos também é crucial para amostras de qualidade e para o bem-estar dos animais.