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Generación de anticuerpos: Producción de anticuerpos monoclonales mediante hibridatos

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Los anticuerpos son una poderosa herramienta para la investigación y el diagnóstico, lo que significa que a menudo es necesario producirlos en grandes cantidades.

El primer paso para generar anticuerpos es inyectar el antígeno de interés en un animal huésped. El antígeno activa las células B del huésped que luego producen y liberan anticuerpos específicos de ese antígeno. A continuación, se realiza un cribado regular de los antisueros del animal huésped para detectar la presencia del anticuerpo diana, utilizando ELISA u otro método de detección. Una vez detectado, se extrae el bazo del animal huésped, que contiene las células B. Si todas las células B del bazo están ahora aisladas, esto debería incluir una población que segrega anticuerpos contra el antígeno de interés. Nos referimos a esta población como policlonal, porque cada célula probablemente ligada a un epítopo diferente del antígeno, y por lo tanto, generó su propio anticuerpo individual y único.

Para generar anticuerpos monoclonales, los anticuerpos elevados para reconocer un epítopo específico, la célula B individual que produce el anticuerpo deseado primero debe aislarse y cultivarse. Desafortunadamente, las células B no sobreviven bien en el cultivo. Así que para superar este obstáculo, los científicos fusionan las células B con células de mieloma inmortales, lo que resulta en hibridatos. Estas células se cultivan en un medio selectivo que sólo permite que los hibridatos crezcan y liberen anticuerpos. Una vez más, el medio se examinan utilizando un método como ELISA para el anticuerpo deseado. Una vez detectados, los hibriomas se clonan a través de un proceso llamado dilución limitante, una dilución en serie del cultivo padre, que debería dar lugar a que las células individuales se salpiquen en los pozos de una placa de cribado. Esto permite el crecimiento de hibridatos a partir de una sola célula madre, produciendo una línea celular monoclonal que sólo libera el anticuerpo deseado. Estas líneas monoclonales se pueden expandir en frascos de cultivo de tejido para producir grandes cantidades de anticuerpos monoclonales. Después de esto, a medida que las células comienzan a morir, los anticuerpos se pueden precipitar desde el medio con sulfato de amonio. Normalmente, en solución, los anticuerpos interactúan con el agua a través de interacciones hidrófilas. Sin embargo, el amonio y el sulfato son iones altamente cargados que separan las moléculas de agua de los anticuerpos, disminuyendo la solubilidad de los anticuerpos y haciendo que se precipiten.

Para empezar, primero compruebe la lista de materiales y prepare todos los medios, suministros y superficies de trabajo para el protocolo.

Luego, encienda un baño de agua y colóquelo en 37 grados Centígrados. A continuación, agregue 10 mililitros de RPMI completo a un tubo cónico de 15 mililitros y 15 mililitros de RPMI completo a un matraz de cultivo celular T75 y déjalos a un lado. Con precaución y usando el equipo de protección personal adecuado, retire el vial congelado que contiene células de hybridoma del almacenamiento de nitrógeno líquido. Para liberar la presión dentro del vial, afloje ligeramente la tapa. Ahora, incubar cuidadosamente el vial en el baño de agua, asegurándose de que la tapa permanece por encima de la superficie del agua para minimizar las posibilidades de contaminación. Cuando las células estén casi desconadas, que normalmente toma alrededor de dos minutos, mueva el vial a la capucha del cultivo de tejido.

A continuación, limpie el exterior del vial con 70% de etanol antes de retirar la tapa. Con una pipeta estéril, transfiera las células al tubo cónico que contiene 10 mililitros de medio RPMI completo. Luego, centrifugar el tubo durante cinco minutos a 1200 RPM. Después de la centrifugación, mueva el tubo de nuevo a la capucha de tejido y limpie el exterior del tubo con etanol. Sin molestar el pellet, deseche el sobrenadante y luego agregue cinco mililitros de medio RPMI completo fresco y pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para resuspender. A continuación, transfiera las células al matraz de cultivo celular T75 y coloque el matraz dentro de una incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados centígrados. Permita que las células alcancen aproximadamente el 80% de confluencia, que generalmente toma alrededor de tres días. Observe que las células de hybridoma no son adherentes y crecerán suspendidas en el medio. El tiempo para alcanzar suficiente confluencia puede variar en función del número inicial de células vivas y el tipo de célula de hibribio utilizado.

Una vez que las células sean lo suficientemente confluentes, utilice una pipeta estéril de 25 mililitros para transferirlas desde el matraz de cultivo a un tubo centrífugo cónico. Reventar las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Mientras que las células están en la centrífuga, agregue 18 mililitros de RPMI completo en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular T75 y deje estos a un lado. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y resuspenda suavemente el pellet celular en seis mililitros de RPMI completo. A continuación, agregue dos mililitros de la suspensión celular en cada uno de los tres nuevos matraces de cultivo celular. Finalmente, coloque los matraces en una incubadora establecida en 5% de dióxido de carbono y 37 grados Celsius e incubar hasta que los matraces sean alrededor del 80% de confluentes, aproximadamente tres días.

En este punto, las células están listas para continuar su crecimiento en el medio libre de suero diseñado para líneas celulares de hibrido, como el medio líquido basal HB disponible comercialmente que contiene el suplemento HB101. Transfiera las células de cada matraz de cultivo celular a tubos cónicos de centrífuga y luego peletizar las células por centrifugación a 1200 RPM durante cinco minutos. Ahora, agregue 230 mililitros de medio libre de suero HB101 complementado en cada uno de los seis matraces de cultivo celular de 225 centímetros cuadrados y déjalos a un lado. Una centrifugación completa, retire el sobrenadante y resuspenda cada pellet en 10 mililitros de medio HB101 suplementario. Luego, en cada matraz de cultivo celular, agregue cinco mililitros de la suspensión celular. Coloque los matraces en la incubadora de dióxido de carbono del 5% a 37 grados Centígrados y continúe cultivando las células durante unas tres semanas. Durante este tiempo, las células producirán y liberarán el anticuerpo monoclonal de interés en el medio de cultivo y el anticuerpo estará listo para la purificación cuando las células comiencen a morir.

Para eliminar los desechos celulares de los medios de cultivo que contienen anticuerpos, vierta el contenido de los matraces de cultivo en tubos para un rotor de ángulo fijo. Coloque los tubos en el rotor y asegúrese de que esté nado correctamente antes de la centrifugación. Gire los tubos a 10.000 RPM durante ocho minutos. Mientras las muestras son centrifugadoras, coloque un vaso de precipitados de plástico de dos litros con una barra de agitación en un cubo de hielo y luego coloque el cubo de hielo en un plato de agitación.

A continuación, coloque una tapa de filtro de 500 mililitros en una botella de un litro. Conecte esta unidad de filtro superior a una casa utilizando el tubo adecuado. A continuación, vierta el sobrenadante que contiene el anticuerpo en la parte superior del filtro. Centrifugar el medio restante para separar los desechos celulares del sobrenadante que contiene anticuerpos. Cuando la parte superior del filtro esté llena de sobrenadant, inicie el vacío. Luego, cuando la botella de recolección de un litro esté casi llena, retire la tapa del filtro y vierta el sobrenadante filtrado en el vaso de precipitados de dos litros sobre hielo. Repita los pasos de filtración hasta que se procese todo el sobrenadante.

Cuando toda la muestra haya sido procesada, pese 295 gramos de sulfato de amonio por cada litro de sobrenadante filtrado. Comience la placa de agitación y agregue lentamente el sulfato de amonio al sobrenadante durante las próximas horas. Esto evita una alta concentración localizada de sal de sulfato de amonio que puede hacer precipitar proteínas no deseadas. Una vez que se haya añadido todo el sulfato de amonio, cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio y muévalo, junto con la placa de agitación, a una cámara fría a cuatro grados centígrados y póngalo para agitar la solución de anticuerpos durante la noche.

A la mañana siguiente, vierta la solución de anticuerpos que contiene sulfato de amonio del vaso de precipitados de dos litros en tubos limpios para el rotor de ángulo fijo. Centrifugar los tubos a 6500 RPM durante 20 minutos sin romper para peletizar el anticuerpo en la parte inferior de los tubos. A continuación, aspirar el sobrenadante, usando precaución para no chupar el pellet suave. Continúe utilizando el mismo conjunto de tubos para recoger el anticuerpo peletado del resto del sobrenadante que contiene sulfato de amonio. Después de la última aspiración, vuelva a suspender cada pellet de anticuerpos en aproximadamente un mililitro de PBS.

Para eliminar el sulfato de amonio de la solución de anticuerpos, primero corte aproximadamente una pulgada de tubo de diálisis para cada mililitro de solución de anticuerpos. A continuación, limpie el tubo con agua destilada y ate un nudo en un extremo del tubo. Llene el tubo con agua destilada para comprobar si hay fugas del nudo. Si no hay fugas después de unos minutos, vacíe el agua del tubo.

A continuación, pipetear la solución de anticuerpos en el tubo. Para recuperar tantos anticuerpos como sea posible, enjuague los tubos con 0,25 mililitros adicionales de PBS y transfiera esto también al tubo. Asegure la parte superior del tubo lo más cerca posible de la solución con un clip de diálisis. Luego, pegue la parte superior del tubo en la parte superior exterior de un vaso de precipitados de cuatro litros con la parte llena del tubo colgando en el vaso de precipitados. Ahora, lleve el vaso de precipitados a la sala fría de cuatro grados Celsius y colóquelo en un plato de agitación. Llene el vaso de precipitados hasta la parte superior con PBS y agregue una barra de agitación. Deje que el tubo y la solución se revuelvan durante aproximadamente ocho horas. A la mañana siguiente, reemplace el PBS en el vaso de precipitados con PBS fresco y luego deje el vaso de precipitados para agitar de nuevo durante aproximadamente ocho horas. Más tarde esa noche, repita el proceso una última vez. Por la mañana, abra el tubo de diálisis y luego transfiera la solución de anticuerpos del tubo a tubos cónicos de 15 mililitros. Para eliminar cualquier precipitante que se haya formado durante la diálisis, centrifugar los tubos durante cinco minutos a 1200 RPM. Finalmente, transfiera el sobrenadante a tubos nuevos.

Para cuantificar la concentración de anticuerpos, primero haga una dilución de 20 veces añadiendo cinco microlitros de una alícuota de anticuerpos a 95 microlitros de PBS. A continuación, pipetear el anticuerpo diluido en una cubeta y utilizar un espectrofotómetro para registrar la concentración en 280 nanómetros. A continuación, calcule la concentración de anticuerpos utilizando la fórmula que se muestra. Por último, etiquete los viales de la tapa del tornillo con el nombre del anticuerpo, la concentración, la fecha de preparación y, si corresponde, el número de lote y el nombre del experimentador, y luego alíbe el anticuerpo en los viales de la tapa del tornillo etiquetados. Estos se pueden almacenar a menos 80 grados Celsius hasta que sea necesario.

Ejemplo de rendimientos utilizando la línea de hibrigoma 120G8 anti-ratón CD317 o PDCA-1 oscilaron entre 44 y 99,6 miligramos, que normalmente produce, en promedio, 67,3 miligramos de cantidad. Es importante tener en cuenta que cada ejecución de producción con la misma línea celular de hybridoma puede ser ligeramente diferente en la cantidad de anticuerpos monoclonales disponibles al final.

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