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免疫荧光显微镜:石蜡内嵌组织部分的免疫荧光染色
 

免疫荧光显微镜:石蜡内嵌组织部分的免疫荧光染色

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细胞中蛋白质的功能很大程度上取决于它在细胞内的正确定位。免疫荧光显微镜是一种利用荧光染料在细胞内可视化蛋白质的方法。荧光染料是一种荧光剂,它是一种分子,通过称为激发的过程吸收特定波长的光能,然后以不同波长(称为发射)立即释放能量。

荧光染料与靶性特异性抗体结合,并通过免疫染色引入培养细胞或组织。当这种初级抗体与感兴趣的蛋白质结合时,该蛋白质会用荧光染料进行标记。或者,荧光染料可以与二级抗体(而不是原抗体)结合,二次抗体与蛋白质原抗体复合物结合以标记靶标。之后,样品被密封在抗褪色安装介质中,以保持荧光标记,然后准备在荧光显微镜上成像。

荧光显微镜配有强大的光源。光束首先通过激励滤波器,该滤光片只允许激发波长的光通过。然后,激发光到达一个称为二色镜或光束分割器的专用反射镜,该反射器旨在选择性地将激发波长反射至物镜。然后,镜头将光线聚焦到样品中的一个小区域。到达样品后,光会激发荧光道,然后以不同的波长发射光能。此光通过物镜传回二色镜。由于发射波长与激发波长不同,二色镜允许发射光通过。然后,它通过第二个滤波器,称为发射滤波器,它消除了来自可能存在的任何其他波长的光。之后,光线现在到达目镜或照相机,在那里它们呈现从特定荧光道发出的光创建的放大图像。此图像表示感兴趣的蛋白质在细胞内的位置。

DNA结合荧光染料通常与免疫染色一起使用,将细胞内的细胞核作为参考点。多个不同荧光道,具有不同的激发发射波长,可用于同一样品中的不同蛋白质,以比较蛋白质的定位。

本视频演示了在组织样品中对感兴趣的蛋白质进行免疫荧光染色的过程,随后在荧光显微镜上成像样品。

在开始染色过程之前,在嵌入过程中脱水的截面需要重新脱水。为此,首先,将幻灯片放入滑架,然后将幻灯片完全浸入 100% Xlene 等构体中。让幻灯片孵育三分钟。然后,从容器中取出滑片,用纸巾擦去多余的二甲苯,并将其放入新的二甲苯浴缸中,再放置三分钟。每次在新的容器中重复这种孵育,用新鲜的二甲苯,用纸巾擦拭幻灯片,然后再转移到新容器,共孵育三个。接下来,在一系列分级乙醇溶液中孵育各部分,从100%乙醇开始两分钟。用纸巾擦拭滑架,并将幻灯片转移到 100% 乙醇的新容器中再再两分钟。继续洗涤循环,用纸巾擦拭多余的乙醇,并在指定时间内按照指示的乙醇浓度将滑片转移到新浴缸。最后一次乙醇清洗后,摆脱多余的溶液,在1X PBS中孵育幻灯片5分钟。

要开始染色过程,首先,使用 PAP 笔圈出各部分,以确定缓冲区需要覆盖的最小区域。一旦在幻灯片上清楚地标记了截面,向每张幻灯片添加 100 微升的阻塞缓冲液,确保覆盖整个截面表面。在组织覆盖在阻塞缓冲液中后,将幻灯片放在加湿室中。让幻灯片在室温下孵育一小时。

在所需的孵育时间之后,将其从幻灯片上排出,从而清除阻塞缓冲液。接下来,稀释阻塞缓冲液中的原抗体。对于1:100稀释,将990微升的阻塞缓冲液加入1.5毫升的离心管中,然后将10微升的原抗体添加到同一管中。将一张幻灯片标记为控件,然后添加 100 微升的阻塞缓冲液。此对照将有助于识别二次抗体的任何非特异性结合。现在,在剩余的幻灯片中加入100微升的原抗体缓冲液。在黑暗中,在四摄氏度的加湿室中孵育部分过夜。

在过夜孵育后,从腔室中取出部分,并将主要抗体从每个滑轨和阻塞缓冲液中排出。将幻灯片放入滑架,然后在 1X PBS 中清洗三次,每次 10 分钟。当幻灯片在1X PBS中洗涤时,稀释阻塞缓冲液中的二次抗体。对于1:200稀释,将995微升的阻塞缓冲液加入1.5毫升的管子中,然后将5微升的二级抗体加入同一管。将二级抗体添加到所有部分(包括对照部分),并在防光室中孵育一小时。当计时器响起时,从培养箱中删除幻灯片。将二级抗体从各部分排出。取出辅助抗体后,将幻灯片放入滑轨架中,然后将幻灯片完全浸入 1X PBS 中 10 分钟,防止光线照射。重复此洗涤三次,每次洗涤使用新鲜的 1X PBS。进行下垂后,在每个幻灯片中加入两到三滴含有 DAPI 的安装介质,并在样品上放置一个玻璃盖玻片。在使用荧光示波器成像部分之前,让幻灯片在黑暗的地方过夜干燥。

在成像过程中,图像捕获的详细信息将取决于可用的特定显微镜和软件。但是,在此特定示例中,软件 Leica 应用程序套件,版本 3。8,用于执行分析。使用此程序,单击"获取"选项卡和图像叠加采集模式,同时启用 DAPI 和 RFP。接下来,调整 DAPI 和 RFP 的曝光、增益和伽玛,使用软件定义的默认设置进行初始操作,然后通过修改曝光时间和增益来优化亮度,同时牢记最小最佳设置是避免样品的图像饱和和光漂白。可以修改 Gamma 以优化图像的较暗区域。

调整设置后,按"获取叠加"按钮创建 DAPI 和 RFP 曝光的叠加图像。此示例图像,使用演示的技术捕获,显示了小鼠乳腺肿瘤部分,染色的抗体F4/80,检测抗原,在巨噬细胞和其他骨髓细胞上,以红色表示。由于使用了含DAPI的安装介质,核以蓝色显示。成像数据将提供有关组织部分蛋白质的强度和定位的信息。

例如,在沾有F4/80的肿瘤图像中,观察到这种抗原的细胞表面染色。这些数据还可以提供有关组织部分内特定细胞群的频率的信息。这可以通过计算正染色细胞的数量(此处以红色显示)并将其与总细胞群(以蓝色显示)进行比较,并使用以下方程计算频率来量化。

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