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Microscopie d'immunofluorescence : Coloration d'immunofluorescence des sections de tissu paraffin-incorporé

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La fonction d'une protéine dans une cellule dépend en grande partie de sa localisation appropriée dans la cellule. La microscopie d'immunofluorescence est une méthode par laquelle une protéine peut être visualisée à l'intérieur des cellules à l'aide de colorants fluorescents. Un colorant fluorescent est un fluorophore, c'est-à-dire une molécule qui absorbe l'énergie lumineuse à une longueur d'onde spécifique par un processus appelé excitation, puis libère immédiatement l'énergie à une longueur d'onde différente, connue sous le nom d'émission.

Les colorants fluorescents sont conjugués à un anticorps spécifique à la cible et introduits dans des cellules ou des tissus cultivés par immunostaining. Lorsque cet anticorps primaire se lie à la protéine d'intérêt, la protéine est étiquetée avec le colorant fluorescent. Alternativement, le colorant fluorescent peut être conjugué à un anticorps secondaire, au lieu de l'anticorps primaire, et l'anticorps secondaire se lie au complexe d'anticorps primaires protéiques pour étiqueter la cible. Après cela, l'échantillon est scellé dans un milieu de montage antifade pour préserver l'étiquetage de fluorescence et est ensuite prêt pour l'imagerie sur un microscope à fluorescence.

Un microscope à fluorescence est équipé d'une puissante source de lumière. Le faisceau lumineux passe d'abord à travers un filtre d'excitation, ce qui permet seulement à la lumière à la longueur d'onde d'excitation de passer à travers. La lumière d'excitation atteint alors un miroir spécialisé, appelé miroir dichroique ou un fendeur de faisceau, qui est conçu pour refléter sélectivement la longueur d'onde d'excitation vers une lentille objective. L'objectif concentre ensuite la lumière sur une petite région de l'échantillon. En atteignant l'échantillon, la lumière excite les fluorophores, qui émettent ensuite l'énergie lumineuse à une longueur d'onde différente. Cette lumière est transmise à travers la lentille objective au miroir dichroïque. Étant donné que la longueur d'onde d'émission est différente de la longueur d'onde d'excitation, le miroir dichroic permet à la lumière d'émission de passer à travers. Ensuite, il passe par un deuxième filtre, appelé filtre d'émission, qui élimine la lumière de toute autre longueur d'onde qui peut être présent. Après cela, les rayons lumineux atteignent maintenant l'oculaire ou la caméra, où ils présentent une image agrandie créée à partir de la lumière émise par les fluorophores spécifiques. Cette image représente l'emplacement de la protéine d'intérêt dans la cellule.

Les colorants fluorescents liant l'ADN sont souvent utilisés avec l'immunostaining pour étiqueter les noyaux comme point de référence dans les cellules. Plusieurs fluorophores différents, avec différentes longueurs d'onde d'émission d'excitation, peuvent être utilisés pour différentes protéines dans le même échantillon pour comparer la localisation des protéines.

Cette vidéo démontre la procédure pour la coloration immunofluorescente d'une protéine d'intérêt dans un échantillon de tissu suivi de l'imagerie de l'échantillon sur un microscope de fluorescence.

Avant de commencer le processus de coloration, les sections, qui ont été déshydratées pendant le processus d'intégration, doivent être réhydratées. Pour ce faire, d'abord, placez les diapositives dans un porte-diapositives, puis submergez complètement les diapositives dans des isores 100% Xlene. Laisser les glissières incuber pendant trois minutes. Ensuite, retirez les glissières du récipient, essuyez tout excès de Xylène avec un essuie-tout, et placez-les dans un nouveau bain de xylène dans un contenant frais, pendant trois minutes supplémentaires. Répétez cette incubation à chaque fois dans un nouveau récipient avec du xylène frais et essuyant les lames avec des essuie-tout avant de le transférer dans le nouveau récipient, pour un total de trois incubations. Ensuite, incubez les sections dans une série de solutions d'éthanol gradué, en commençant par 100% d'éthanol pendant deux minutes. Essuyez le toboggan à l'eau avec un essuie-tout et transférez les lames dans un nouveau contenant d'éthanol à 100 % pendant encore deux minutes. Poursuivre le cycle de lavage, essuyer l'excès d'éthanol avec un essuie-tout et transférer les glissières dans un nouveau bain, en suivant les concentrations indiquées d'éthanol pour le temps spécifié. Après le lavage final à l'éthanol, secouez la solution excédentaire et incubez les glissières en 1X PBS pendant cinq minutes.

Pour commencer le processus de coloration, d'abord, encerclez les sections avec un stylo PAP pour identifier la zone minimale que les tampons doivent couvrir. Une fois que les sections sont clairement marquées sur la diapositive, ajouter 100 microlitres de tampon de blocage à chaque diapositive, en veillant à couvrir toute la surface de la section. Une fois que les tissus sont recouverts d'un tampon de blocage, placez les glissières dans une chambre humidifiée. Laisser les toboggans incuber pendant une heure à température ambiante.

Après le temps d'incubation souhaité, retirez le tampon de blocage en le vidant de la glissière. Ensuite, diluer l'anticorps primaire en bloquant le tampon. Pour une dilution de 1:100, ajouter 990 microlitres de tampon de blocage à un tube centrifugeuse de 1,5 millilitre, suivi de 10 microlitres de l'anticorps primaire au même tube. Étiquetez une diapositive comme un contrôle, puis ajoutez 100 microlitres de tampon de blocage. Ce contrôle permettra d'identifier toute liaison non spécifique de l'anticorps secondaire. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de tampon d'anticorps primaire aux diapositives restantes. Incuber les sections toute la nuit dans une chambre humidifiée à quatre degrés Celsius, dans l'obscurité.

Après l'incubation de nuit, retirez les sections de la chambre et videz l'anticorps primaire de chaque diapositive et du tampon de blocage du contrôle. Placez les glissières dans un toboggan, puis lavez-les trois fois en 1X PBS pendant dix minutes chacune. Pendant que les glissières se lavent en 1X PBS, diluez l'anticorps secondaire en bloquant le tampon. Pour une dilution de 1:200, ajouter 995 microlitres de tampon de blocage à un tube de 1,5 millilitre, suivi de cinq microlitres de l'anticorps secondaire au même tube. Ajoutez l'anticorps secondaire à toutes les sections, y compris le contrôle, et incuber pendant une heure dans une chambre humidifiée protégée de la lumière. Lorsque la minuterie retentit, retirez les diapositives de l'incubateur. Égoutter l'anticorps secondaire des sections. Une fois l'anticorps secondaire enlevé, placez les glissières dans un toboggan, puis submergez complètement les glissières en 1X PBS pendant 10 minutes, à l'abri de la lumière. Répétez ce lavage trois fois, en utilisant frais 1X PBS pour chaque lavage. Après les lavages, ajouter deux à trois gouttes de support de montage contenant d'Un DAPI à chaque diapositive et placer une feuille de verre sur les échantillons. Laissez les glissières sécher toute la nuit dans un endroit sombre avant d'imagerier les sections à l'aide d'une lunette fluorescente.

Pendant l'imagerie, les détails de la capture d'image dépendront du microscope spécifique et du logiciel disponible. Cependant, dans cet exemple particulier, le logiciel Leica Application Suite, Version 3. 8, est utilisé pour effectuer l'analyse. À l'aide de ce programme, cliquez sur l'onglet Acquérir et en mode Acquisition de la pariation d'images, activez à la fois DAPI et DFP. Ensuite, ajustez l'exposition, gain et Gamma pour le DAPI et la DFP, en prenant une première en utilisant les paramètres par défaut définis par le logiciel, puis en optimisant la luminosité en modifiant le temps d'exposition et le gain, en gardant à l'esprit que les paramètres optimaux minimaux sont souhaitable d'éviter la saturation de l'image et le photoblanchiment des échantillons. Gamma peut être modifié pour optimiser les zones plus sombres d'une image.

Une fois les paramètres ajustés, appuyez sur le bouton Acquire Overlay pour créer des images de overpose des expositions DAPI et DFP. Cet exemple d'image, capturée à l'aide de la technique démontrée, montre une section de tumeur mammaire de souris, tachée avec l'anticorps F4/80, qui détecte un antigène, représenté en rouge, sur des macrophages et d'autres cellules myéloïdes. Depuis que les supports de montage contenant du DAPI ont été utilisés, les noyaux sont représentés en bleu. Les données de l'imagerie fourniront des informations sur l'intensité et la localisation de la protéine dans la section tissulaire.

Par exemple, dans l'image de la tumeur souillée avec F4/80, la coloration de surface de cellules de cet antigène est observée. Ces données peuvent également fournir des informations sur la fréquence des populations cellulaires spécifiques dans la section tissulaire. Cela peut être quantifié en comptant le nombre de cellules tachées positivement, ici montré en rouge, et en comparant cela avec la population cellulaire totale, montrée en bleu, et en calculant la fréquence à l'aide de l'équation suivante.

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