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Microscopía de inmunofluorescencia: Tinción de inmunofluorescencia de secciones de tejido incrustado por parafina

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La función de una proteína en una célula depende en gran medida de su correcta localización dentro de la célula. La microscopía de inmunofluorescencia es un método mediante el cual una proteína se puede visualizar dentro de las células utilizando tintes fluorescentes. Un tinte fluorescente es un fluoróforo, es decir, una molécula que absorbe la energía de la luz a una longitud de onda específica mediante un proceso llamado excitación, y luego libera inmediatamente la energía en una longitud de onda diferente, conocida como emisión.

Los colorantes fluorescentes se conjugan con un anticuerpo específico del objetivo y se introducen en las células o tejidos cultivados mediante inmunomanchas. Cuando este anticuerpo primario se une a la proteína de interés, la proteína se etiqueta con el tinte fluorescente. Alternativamente, el tinte fluorescente se puede conjugar con un anticuerpo secundario, en lugar del anticuerpo primario, y el anticuerpo secundario se une al complejo de anticuerpos primarios de proteína para etiquetar el objetivo. Después de eso, la muestra se sella en un medio de montaje antidescolorpara para preservar el etiquetado de fluorescencia y luego está lista para la toma de imágenes en un microscopio de fluorescencia.

Un microscopio de fluorescencia está equipado con una potente fuente de luz. El haz de luz pasa primero a través de un filtro de excitación, que permite que sólo la luz en la longitud de onda de excitación pase a través. La luz de excitación llega entonces a un espejo especializado, llamado espejo dicroro o divisor de haz, que está diseñado para reflejar selectivamente la longitud de onda de excitación hacia una lente objetivo. A continuación, la lente enfoca la luz en una pequeña región de la muestra. Al llegar a la muestra, la luz excita a los fluoróforos, que luego emiten la energía de la luz a una longitud de onda diferente. Esta luz se transmite de vuelta a través de la lente objetivo al espejo dicroico. Dado que la longitud de onda de emisión es diferente de la longitud de onda de excitación, el espejo dicroico permite que la luz de emisión pase a través. Luego, pasa a través de un segundo filtro, llamado filtro de emisión, que elimina la luz de cualquier otra longitud de onda que pueda estar presente. Después de eso, los rayos de luz ahora llegan al ocular o a la cámara, donde presentan una imagen magnificada creada a partir de la luz emitida por los fluoróforos específicos. Esta imagen representa la ubicación de la proteína de interés dentro de la célula.

Los colorantes fluorescentes de unión al ADN se utilizan a menudo junto con la inmunomancha para etiquetar los núcleos como un punto de referencia dentro de las células. Múltiples fluoróforos diferentes, con diferentes longitudes de onda de emisión de excitación, se pueden utilizar para diferentes proteínas dentro de la misma muestra para comparar la localización de las proteínas.

Este vídeo muestra el procedimiento para la tinción inmunofluorescente de una proteína de interés en una muestra de tejido seguida de la toma de imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia.

Antes de comenzar el proceso de tinción, las secciones, que se deshidrataron durante el proceso de incrustación, deben rehidratarse. Para ello, primero, coloque las diapositivas en un portaobjetos y luego sumerja completamente las diapositivas en isómeros 100% xlenos. Deje que las diapositivas se incuban durante tres minutos. A continuación, retire los portaobjetos del recipiente, limpie cualquier exceso de Xileno con una toalla de papel y colóquelos en un nuevo baño de Xileno en un recipiente nuevo, durante otros tres minutos. Repita esta incubación cada vez en un nuevo recipiente con xileno fresco y limpiando los portaobjetos con toallas de papel antes de transferirlo al nuevo recipiente, para un total de tres incubaciones. A continuación, incubar las secciones en una serie de soluciones de etanol calificadas, comenzando con 100% etanol durante dos minutos. Limpie la portaobjetos con una toalla de papel y transfiera las diapositivas a un nuevo recipiente de etanol 100% durante otros dos minutos. Continúe el ciclo de lavado, limpiando el exceso de etanol con una toalla de papel y transfiriendo los portaobjetos a un baño nuevo, siguiendo las concentraciones indicadas de etanol durante el tiempo especificado. Después del lavado final de etanol, sacuda el exceso de solución e incubar los portaobjetos en 1X PBS durante cinco minutos.

Para comenzar el proceso de tinción, primero, circule las secciones con un lápiz PAP para identificar el área mínima que los búferes necesitan cubrir. Una vez que las secciones estén claramente marcadas en la diapositiva, agregue 100 microlitros de amortiguador de bloqueo a cada diapositiva, asegurándose de cubrir toda la superficie de la sección. Después de que los tejidos estén cubiertos con tampón de bloqueo, coloque los portaobjetos en una cámara humidificada. Deje que los toboganes se incuban durante una hora a temperatura ambiente.

Después del tiempo de incubación deseado, retire el tampón de bloqueo drenándolo de la diapositiva. A continuación, diluir el anticuerpo primario en el tampón de bloqueo. Para una dilución de 1:100, agregue 990 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo centrífugo de 1,5 mililitros, seguido de 10 microlitros del anticuerpo primario al mismo tubo. Etiquete una diapositiva como un control y, a continuación, agregue 100 microlitros de búfer de bloqueo. Este control ayudará a identificar cualquier unión no específica del anticuerpo secundario. Ahora, agregue 100 microlitros de tampón de anticuerpos primarios a las diapositivas restantes. Incubar las secciones durante la noche en una cámara humidificada a cuatro grados centígrados, en la oscuridad.

Después de la incubación durante la noche, retire las secciones de la cámara y drene el anticuerpo primario de cada diapositiva y el tampón de bloqueo del control. Coloque las diapositivas en una portaobjetos y luego lávelas tres veces en 1X PBS durante diez minutos cada una. Mientras las diapositivas se lavan en 1X PBS, diluya el anticuerpo secundario en el tampón de bloqueo. Para una dilución de 1:200, agregue 995 microlitros de tampón de bloqueo a un tubo de 1,5 mililitros, seguido de cinco microlitros del anticuerpo secundario al mismo tubo. Añadir el anticuerpo secundario a todas las secciones, incluido el control, e incubarlos durante una hora en una cámara humidificada protegida de la luz. Cuando suene el temporizador, retire las diapositivas de la incubadora. Escurra el anticuerpo secundario de las secciones. Una vez que se retire el anticuerpo secundario, coloque los portaobjetos en un portaobjetos y luego sumerja completamente los portaobjetos en 1X PBS durante 10 minutos, protegidos de la luz. Repita este lavado tres veces, usando 1X PBS fresco para cada lavado. Después de los lavados, agregue de dos a tres gotas de soporte de montaje que contengan DAPI a cada diapositiva y coloque una cubierta de vidrio en las muestras. Deje que las diapositivas se sequen durante la noche en un lugar oscuro antes de tomar imágenes de las secciones con un endoscopio fluorescente.

Durante la toma de imágenes, los detalles de la captura de imágenes dependerán del microscopio y el software específicos disponibles. Sin embargo, en este ejemplo en particular, el software Leica Application Suite, Versión 3. 8, se utiliza para realizar el análisis. Con este programa, haga clic en la pestaña Adquirir y en el modo Adquisición de superposición de imágenes, habilite DAPI y RFP. A continuación, ajuste la exposición, la ganancia y la gamma para DAPI y RFP, tomando una inicial utilizando los ajustes predeterminados definidos por el software y, a continuación, optimizando el brillo modificando el tiempo de exposición y la ganancia, teniendo en cuenta que los ajustes óptimos mínimos son para evitar la saturación de la imagen y el fotoblanqueo de las muestras. Gamma se puede modificar para optimizar las áreas más oscuras de una imagen.

Una vez ajustados los ajustes, pulse el botón Adquirir superposición para crear imágenes superpuestas de las exposiciones DAPI y RFP. Esta imagen de ejemplo, capturada con la técnica demostrada, muestra una sección de tumor mamario del ratón, manchada con el anticuerpo F4/80, que detecta un antígeno, representado en rojo, en macrófagos y otras células mieloides. Desde que se utilizó el medio de montaje que contiene DAPI, los núcleos se muestran en azul. Los datos de la imagen proporcionarán información sobre la intensidad y localización de la proteína dentro de la sección de tejido.

Por ejemplo, en la imagen del tumor manchado con F4/80, se observa la tinción de la superficie celular de este antígeno. Estos datos también pueden proporcionar información sobre la frecuencia de poblaciones celulares específicas dentro de la sección de tejido. Esto se puede cuantificar contando el número de celdas manchadas positivamente, aquí se muestraen en rojo, y comparando eso con la población total de celdas, mostrada en azul, y calculando la frecuencia usando la siguiente ecuación.

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