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Técnicas basadas en inmunoprecipitación
 

Técnicas basadas en inmunoprecipitación: purificación de proteínas endógenas mediante cuentas de agarosa

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La inmunoprecipitación, o IP, es una técnica ampliamente utilizada para aislar una proteína de interés de un lisado celular o tisular o un fluido corporal para la caracterización de proteínas o para investigar interacciones proteína-proteína.

El proceso comienza con un anticuerpo, que tiene una alta afinidad y especificidad para la proteína diana. Este anticuerpo se mezcla con la muestra, lo que permite la formación de complejos de anticuerpos objetivo. Cualquier proteína unida a la proteína diana también se une indirectamente al anticuerpo en el proceso. A continuación, la solución se incuba con cuentas de agarosa, conjugada con una proteína bacteriana, que tiene una fuerte afinidad por la región constante de los anticuerpos. La proteína bacteriana se une al anticuerpo y conecta los complejos objetivo de anticuerpos con las cuentas. A continuación, la solución se centrifuga para precipitar las perlas, extrayendo así todo el complejo que contiene el anticuerpo de unión, la proteína diana y cualquier proteína que interactúe. Finalmente, las proteínas unidas se extraen de las cuentas y se liberan entre sí y se utilizan para el análisis posterior por técnicas como la hincha occidental.

Varias variaciones de diferentes partes de esta técnica se utilizan comúnmente, como pre-clearing, usando etiquetas de péptidos o cuentas magnéticas, o el análisis de otros socios de unión no proteica. La IP puede ser preceed por un paso de pre-limpieza, para eliminar proteínas no específicas de unión a anticuerpos en la muestra y minimizar el fondo. Esto implica primero incubar la muestra con anticuerpos de control de isotipo, permitiéndoles unirse a estas proteínas, y luego usar cuentas de agarosa para precipitar los complejos. El ejemplo entonces está listo para proceder a la IP real.

Las etiquetas de péptidos son útiles si un anticuerpo específico no está disponible para IP. Aquí, la proteína diana puede ser modificada genéticamente para contener una etiqueta de epítopeno péptido y un anticuerpo contra la etiqueta es capaz de extraer la proteína de interés. Las cuentas magnéticas se utilizan a menudo en lugar de agarosa para precipitar el objetivo. Después de unirse al complejo de anticuerpos, el tubo de muestra se coloca en un campo magnético fuerte, que extrae las perlas de la solución. Esto elimina la necesidad de centrifugación y mejora la velocidad y la comodidad.

La inmunoprecipitación también se utiliza para estudiar proteínas de unión al ADN o al ARN y se conocen como inmunoprecipitación de cromatina e inmunoprecipitación de ARN, respectivamente. Estas variaciones son útiles para solucionar problemas y adaptar el método para diferentes aplicaciones experimentales. En este video, observará cómo pre-borrar un lisado celular y realizar inmunoprecipitación para extraer una proteína de interés, seguido de análisis de manchas occidentales para validar el experimento.

Para empezar, coloque las células pre-recogidas en una microcentrífuga y gire a 13 mil rpm durante tres minutos. Después del giro, retire el sobrenadante y luego resuspenda las células en 500 microlitros de lisis amortiguan RIPA con PMSF. Ahora, interrumpa las células usando unos pulsos rápidos con un vórtice y luego aspirar el lisado unas cuantas veces con una aguja de calibre 25 unida a una jeringa, teniendo cuidado de evitar la creación de burbujas. Coloque las células en hielo durante 15 minutos. Después de incubar las muestras en hielo, centrifugar el lisado durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Etiquete un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Después del giro, transfiera el sobrenadante al tubo recién etiquetado y deseche el pellet. A continuación, pre-borrar el lisado de contaminantes que se unen no específicamente a las perlas de agarosa o el anticuerpo primario mediante la adición de 20 microlitros de las cuentas de proteína A/G PLUS-agarose y un microgramo de un anticuerpo de control de isotipos al lisado, que en este ejemplo es un control de isotipo IgG1 de ratón. Incubar el tubo en un rotador en una sala fría durante 30 minutos. Después de girar el lysato en la cámara frigorífica durante 30 minutos, centrifugar la muestra a 3200 rpm durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Retire el tubo de la centrífuga y transfiera el sobrenadante pre-claro a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con etiqueta fresca. Deseche el pellet.

Ahora, determinar la concentración de proteína del lisado celular mediante la realización de un ensayo de Bradford. Etiqueta siete 1. Tubos de microcentrífuga de 5 mililitros de uno a seis y muestra y alícuota 1000 microlitros del reactivo Bradford en cada tubo. Seis de los tubos se utilizarán para hacer una curva estándar mediante la adición de varias cantidades de cantidades conocidas de BSA a cada tubo. Los importes que se van a agregar se enumeran en esta tabla. En el séptimo tubo de muestra, agregue un microlitro del islato pre-claro. Coloque 200 microlitros de cada uno de los siete tubos en pozos individuales de una placa de fondo plano de 96 pocillos, repitiendo cada muestra en triplicado para que haya tres columnas de siete muestras. Lea la placa en un lector de placas, utilizando una longitud de onda de 595 nanómetros. Después de crear una curva estándar en Excel, calcule la concentración de proteínas del lisado preborrado.

A continuación, etiquetar dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros, uno como control y el otro como prueba, que en este ejemplo, será el anticuerpo c-myc. Coloque 500 microgramos del lisado pre-claro en cada uno de estos tubos y luego traiga el volumen total para cada tubo hasta 500 microlitros usando tampón de lisis. A continuación, agregue dos microgramos del anticuerpo anti-c-mico al tubo del grupo de ensayo. Para el control, agregue dos microgramos del anticuerpo de control de isotipo IgG1 del ratón. Una vez que los anticuerpos se añaden a los tubos, coloque las muestras en un rotador en una cámara fría e incubar durante dos horas. Ahora, agrega las cuentas de agarose. Para ello, se recomienda cortar el extremo de una punta de pipeta y luego, usando esta punta modificada, añadir 200 microlitros de las cuentas de proteína A/G PLUS-agarose a cada tubo. Incubar los tubos de un rotador en la cámara fría durante la noche.

Después de la incubación, retire los tubos del rotador y gire los lysates en el microcentrífugo para tirar hacia abajo de las perlas. Una vez completado el giro, retire los tubos de la centrífuga y aspire el sobrenadante de cada tubo. A continuación, lave las perlas con 500 microlitros de PBS de 1X Dulbecco. Coloque los tubos en una microcentrífuga y gire hacia abajo durante 30 segundos a cuatro grados centígrados. Después de esto, retire el sobrenadante. Repita los pasos de lavado y centrífuga una vez más para un total de dos veces. Retire los tubos de la microcentrífuga y aspire el tampón de cada tubo. Usando puntas de carga de gel, elimina cualquier tampón sobrante de las cuentas, manteniendo las cuentas en hielo para eluir la proteína enlazada.

En este ejemplo, la proteína se eluye en el búfer de ejecución SDS-PAGE hirviendo para el análisis de manchas occidentales. Para ello, resuspenda las perlas en 20 microlitros de tinte de carga SDS-PAGE que contenga beta-mercaptoetanol o BME. Hervir las muestras a 95 grados centígrados durante cinco minutos para disociar los inmunocomplejos de las cuentas. A continuación, centrifugar las perlas a la velocidad máxima durante 10 segundos a temperatura ambiente. Retire los tubos de la microcentrífuga y sosténgalos en un bastidor a temperatura ambiente. Usando puntas de carga de gel, pipetee cuidadosamente las muestras de las perlas y cárguelas en pozos de un gel SDS-PAGE de 4 a 15% de gradiente. Además de las muestras, cargue un carril con una escalera de proteínas, así como un carril con el islapreo pre-despejado para servir como control de carga. Una vez cargado el gel, ejecute el gel a 100 voltios.

Después de que el frente del tinte ha llegado a la parte inferior del gel, que debe tomar aproximadamente una hora, detener el gel y hacer un sándwich de mancha occidental, asegurando que la membrana PVDF está entre el gel y el cátodo. Coloque el sándwich Western blot en el aparato de transferencia y transfiera las proteínas del gel a la membrana durante una hora a 100 voltios. Una vez completada la transferencia, coloque la membrana en cinco mililitros de bloque para evitar que los anticuerpos se adhieran no específicamente a la membrana. Roca a un ajuste bajo durante una hora a temperatura ambiente. Cuando suene el temporizador, quite el búfer de bloqueo. Añadir cinco mililitros del tampón de bloqueo con el anticuerpo de detección a la membrana. Aquí, se utiliza un anticuerpo anti-c-mico, que es diferente al utilizado para el pull down.

Incubar la mancha durante la noche, a cuatro grados centígrados en un balancín en un ajuste bajo. Después de la incubación, retire el anticuerpo y el tampón de bloqueo. Lave la mancha, usando cinco mililitros de TBST durante cinco minutos a temperatura ambiente, en un balancín en un ajuste bajo. Este paso de lavado debe repetirse de dos a cinco veces para un total de tres a seis lavados, utilizando TBST fresco para cada lavado. Añadir cinco mililitros de uno a 1000 anticuerpos secundarios y tampón de bloqueo a la mancha. En este caso, el anticuerpo secundario es la cadena ligera anti-conejo con etiqueta HRP. Incubar la mancha en un balancín en un ajuste bajo para uno nuestro a temperatura ambiente. A continuación, retire el tampón y lave la mancha con cinco mililitros de TBST. Incubar este lavado en un balancín a un ajuste bajo durante cinco minutos a temperatura ambiente. Repita este lavado para un total de seis a 12 lavados, cada uno con cinco mililitros frescos de TBST. Retire el lavado final vertiendo primero el líquido de la mancha. Luego, usando pinzas, coloque el borde de la mancha en una toallita de laboratorio para eliminar cualquier exceso de líquido y luego coloque la mancha en un recipiente nuevo. A continuación, cubra la mancha con 1X Reactivo de Detección Quimioluminiscente e incubar durante un minuto.

Trabajando rápidamente, coloque el borde de la mancha en una toallita de laboratorio para eliminar cualquier exceso de reactivo de detección y luego coloque la mancha en la superficie de imagen de la bandeja imager. Imagen utilizando el programa Chemiluminescent e chemiluminescente para capturar múltiples puntos de tiempo de 10 a 30 segundos. Después de crear una imagen de la mancha, elija una imagen con una visibilidad óptima de la banda y, a continuación, exporte esa imagen. Antes de mover la mancha, utilice el Imager para tomar una foto de la mancha para capturar la ubicación de la escalera. Luego, exporte esa imagen también. Por último, utilizando un software de preparación de diapositivas, como PowerPoint, alinee las bandas y las imágenes de escalera para formar una imagen.

Esta imagen muestra el resultado de la mancha occidental para la inmunoprecipitación de la proteína c-mico de las células de timiocitos. De izquierda a derecha, los carriles representan el control de isotipo, la IP c-myc y la entrada de lisado pre-borrada. El carril en el extremo derecho es una imagen fusionada de la escalera de peso molecular. La banda fuerte, alrededor de 25 kilodaltones es de la cadena ligera y la de 50 kilodaltones es de la cadena pesada del anticuerpo de unión y no son específicos de la IP o las muestras. C-myc corre alrededor de 67 kilodaltones en manchas occidentales y por lo general es visible justo debajo de la banda de escalera de 75 kilodaltones. En esta mancha, la banda c-myc es visible en el segundo carril pero ausente en el primer carril, lo que indica que el anticuerpo IP tiró con éxito por c-myc. No hay banda visible en el carril de lisado pre-claro, lo que sugiere que esta proteína tiene bajos niveles de expresión endógena.

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