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细胞周期分析:使用CFSE染色和流细胞测定法评估刺激后CD4和CD8 T细胞增殖
 

细胞周期分析:使用CFSE染色和流细胞测定法评估刺激后CD4和CD8 T细胞增殖

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对于大多数免疫学研究,测量免疫细胞增殖是一个关键步骤,常用CFSE荧光染料法。正确的细胞分裂对免疫细胞很重要,因为它调节免疫反应的水平和特异性。例如,T细胞增殖以识别和杀死癌细胞,B细胞进行细胞分裂以产生特定的抗体。CSFE测定的总体前提是用绿色荧光染料CFSE染色细胞,这种染料进入活细胞并与体内的蛋白质稳扎结合,从而产生永久标签。因此,当含染料的母细胞分裂时,每个子细胞从母细胞获得一半的荧光。

这个过程在后续的除法中继续,染料强度随着每个除法逐渐降低。在所需的端点处,每个细胞的荧光强度通过流式细胞测量测量。然后,这些数据用于量化细胞经历的分裂的数量和模式。如图所示,荧光最高的细胞群来自父代。第二高属于第二代,等等。峰值数决定单元格分割的数量。

此外,如果使用初级免疫细胞,特定细胞群(例如 T 细胞)可以与 CFSE 一起标记不同颜色的荧光染料,并使用多色流式细胞测定同时识别。新的数据可以绘制在同一图形上,现在显示具有不同CFSE染色强度的T细胞子群,通过该图可以具体分析T细胞的增殖率。本视频演示了CFSE染色小鼠小鼠小鼠小鼠小鼠细胞的方案,该细胞通过抗CD3抗体刺激。其次是染色,以标记T细胞和流动细胞测量,以跟踪其细胞增殖。

首先,穿上适当的防护服和实验室手套。接下来,先用洗涤剂洗一把钳子,用70%的乙醇清洗剪刀,然后用干净的纸巾擦干。将一毫升FCS与49毫升的HBSS在50毫升管中结合,制备50毫升汉克平衡盐溶液(HBSS),将胎儿小牛血清(FCS)浓度为2%。通过轻轻上下移液约10次混合。然后,分离小鼠脾脏细胞,如FACS分离脾B淋巴细胞的视频协议所示。

将四个15毫升的管子贴上一到四个标签,并在第七个分离的脾细胞中添加一乘一乘。接下来,在每个管中加入三毫升的HBSS 2%FCS。然后,将一微升的五微摩尔碳化物氟化物二甲酰酯(CFSE)移液到每个管中。在5%的二氧化碳培养箱中,在37摄氏度下孵育管子10分钟。管1和2中的细胞不会受到刺激。它们将用于揭示脾CD4和CD8T细胞的增殖基础水平。

将 10 毫升 HBSS 2% FCS 移入这些管中。三和四管将受到抗CD3抗体的刺激,以观察对细胞周期的影响。在三和四管中加入10毫升HBSS 2%FCS和抗CD3抗体,最终浓度为每毫升2.5微克。接下来,在370 x g下,在10摄氏度下将所有管子离心7分钟。丢弃上生物。将颗粒重新悬浮在两毫升的 HBSS 2% FCS 中,并将所得溶液移液到六孔板上的单独孔中。小心地将铭牌贴上 1 到 4 的标签,以跟踪样品标识。在37摄氏度和5%的CO2下孵育细胞三天。

在第三天,加入两毫升的HBSS 2%FCS到井1和3,其中应包含管1和3的细胞。上下用力移液,然后将样品转移到标有五毫升的FACS管中。将六孔板放回培养箱中。这些来自第二口和第四口井的剩余细胞将在第五天进行分析,以研究刺激对细胞周期的长期影响。在370 x g下在10摄氏度下将管子离心7分钟,然后丢弃上生子。现在,在每个管中加入100微升的抗体混合物。在黑暗中的冰上孵育管子20分钟。接下来,在每个管中加入一毫升HBSS 2%FCS,并在370 x g下在10摄氏度下将管子离心7分钟。丢弃上生物。在 200 毫升的 HBSS 2% FCS 中重新悬浮颗粒,并混合良好。将重新悬浮的颗粒转移到新的标记的 FACS 管中。

然后,使用流细胞测定法评估T细胞增殖,如FACS协议所示。门细胞选择淋巴CD3阳性细胞,并区分CD4阳性和CD8阳性细胞,并记录管1和3的数据。在第五天,用六孔板中剩余的两口孔中的细胞重复细胞染色过程。

我们将分析CD3刺激对CD4和CD8阳性细胞在刺激后三天和五天细胞周期的影响。首先,单击 FlowJo 图标,将文件拖到"所有示例"窗口中。双击第三天收集的未刺激单元格的文件,以显示 y 轴上向前散射的点图,在 x 轴上显示侧散射。单击多边形,根据其形态圈圈淋巴细胞群。在子填充标识窗口中,命名总体淋巴细胞并单击"确定"。接下来,双击圆圈总体,在新窗口中,在 y 轴上选择 Thy1.2,在 x 轴上选择 CD3。然后,单击多边形以圈出 CD3 和 Thy1.2 双阳性细胞。在新的子填充标识窗口中,命名总体 T 细胞并单击"确定"。接下来,双击圆圈填充。在新窗口中,选择 y 轴上的 CD4 和 x 轴上的 CD8。然后,单击多边形以圈出 CD4 阳性总体。在新的子填充标识窗口中,命名总体 CD4 T-Cells 并单击"确定"。现在,单击多边形以圈出 CD8 阳性总体。在新的子填充标识窗口中,命名总体 CD8 T-Cells 并单击"确定"。对其他文件重复这些步骤。

要确定分割和非分割单元格的频率,首先,通过单击布局编辑器来可视化单元格群。然后,将 CD4 T 细胞和 CD8 T 细胞从四个管中的每一个拖动到"所有样本"窗口。将显示表示人口群的图形。对于每个管,双击 CD8 T 细胞的点图,并在"图形定义"下选择直方图以可视化结果。选择 CFSE 作为参数,以比较每个时间点的刺激细胞群与未刺激的细胞群。非分裂细胞保持较高的CFSE水平,而增殖细胞将CFSE的含量分解为分裂细胞。

现在,在按下 Shift 键时,双击直方图。在新窗口中,单击范围并选择与最高峰值对应的 CFSE 范围。在子填充标识窗口中,命名总体非分割 CD8 T 细胞,并标记人口划分 CD8 单元格。现在,重复一下,选择每个管中的分离和非分离CD4 T细胞。要检查分割 CD3 阳性单元格的频率,请单击表编辑器。然后,将感兴趣的群体、分离 CD8 T 细胞和分割 CD4 T 细胞拖入表中。在"统计"菜单上,选择 T 细胞的频率。然后,单击"创建表"以显示新表中的频率。

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