Mikroinjektion von Drosophila Krankenschwesterzellen: Eine Methode der intrazellulären Verabreichung

- Legen Sie einen Deckelmit sezierten Eikammern auf die Mikroskopstufe. Suchen Sie eine Eikammer der entsprechenden Entwicklungsstufe und Ausrichtung für die Mikroinjektion. In der Mitte bis spätindienigen Eizellen haben die Eizellen ein großes sichtbares Eigelb, und diejenigen in der richtigen Ausrichtung sind mit ihrer vorderen-hinteren Achse senkrecht zur Injektionsrichtung.

Drosophila-Nervenzellen sind eine Gruppe von 15 Zellen in der Eikammer, die für die Ablagerung von mütterlich abgeleiteten Nährstoffen und Biomolekülen in die sich entwickelnde Oozyte verantwortlich sind. Richten Sie das Mikroinjektorsystem auf den entsprechenden Injektions- und Kompensationsdruck ein, um einen gleichmäßigen Injektionsvolumen und einen gleichmäßigen Abfluss zu gewährleisten. Bringen Sie vorsichtig eine zuvor geladene Kapillarnadel in das Sichtfeld, so dass sich die Zellen und die Nadel in derselben Fokalebene befinden.

Stellen Sie sicher, dass keine Luft in der Spitze der Kapillare eingeschlossen ist und dass es einen kontinuierlichen Fluss der Lösung gibt. Passen Sie dann die Z-Position des Objektivs an, um sich auf die Membran zu konzentrieren, die die Follikelzellen von den Ambisszellen trennt, setzen Sie die Nadel in eine Ammenzelle ein und führen Sie die Injektion durch.

Das folgende Protokoll zeigt mikroinjizierende Drosophila-Ammensondenzellen mit fluoreszierenden Oligonukleotid-Sonden, sogenannten molekularen Leuchttürmen, gegen mütterlich beigesteuerte mRNA-Transkripte für die Live-Zell-Bildgebung.

- Für molekulare Baken-Mikroinjektion, wählen Sie die 40x Öl-Objektiv und montieren Sie einen Deckel-Schlupf mit der sezierten Eikammer auf dem Mikroskop-Stadium. Suchen Sie eine Eikammer in der mitte bis spät Entwicklungsphase, die richtig für die Mikroinjektion ausgerichtet ist, dann richten Sie einen Mikroinjektor mit den entsprechenden Injektions- und Kompensationsdrücken ein.

Mit dem Mikromanipulator-Joystick senken Sie vorsichtig eine Nadel, die mit einem Mikroliter molekularer Leuchtmittel in den Öltropfen geladen ist. Bringen Sie die Spitze in den Fokus zur Peripherie des Sichtfeldes. Führen Sie eine saubere Funktion aus, um die Luft von der Nadelspitze zu entfernen und sicherzustellen, dass es Fluss von der Nadel gibt, und bringen Sie die Nadel in die Heimatposition.

Konzentrieren Sie sich auf die zu mikroinjizierende Eikammer und bringen Sie die Nadel in der Nähe des Rands der Eikammer wieder in den Fokus. Führen Sie eine feinjustierte Anpassung der Z-Position des Objektivs durch, so dass die Membran, die die Follikelzellen von den Ambisszellen trennt, im Fokus steht. Setzen Sie die Nadel zur Injektion der molekularen Baken über einen Zeitraum von zwei bis fünf Sekunden in eine Ammeniszellen ein.

- Um einen reproduzierbaren Mikroinjektionserfolg zu gewährleisten, konzentrieren Sie sich sorgfältig auf die Membran, die die Follikelzellen und die Ammenzellen trennt, die injiziert werden, während Sie die Spitze der Nadel mit dem Mikromanipulator in den Fokus rücken.

- Wenn alle molekularen Baken injiziert wurden, entfernen Sie vorsichtig die Nadel und ziehen Sie sie in die Heimatposition. Ändern Sie das Objektiv auf die gewünschte Vergrößerung für die Bildaufnahme, dann konzentrieren Sie sich auf die Eikammer unter dem neuen Objektiv und beginnen Sie die Bildaufnahme.