单蠕虫PCR：提取和放大基因组DNA的方法

- 对于单一蠕虫PCR 分析，允许草本蠕虫自受精并产卵，从而产生基因相同的后代，从而保留改良菌株的副本。然后，将母体转移到含有蠕虫裂解缓冲器的管子上。

将管子冻结在零下 80 摄氏度以打破角质层或外层。 将样品加热到+60摄氏度，将释放细胞内蛋白质的蠕虫细胞与细胞的基因组DNA一起裂解。在此温度下，缓冲区内的蛋白酶 K 会降解蛋白质，尤其是会破坏基因组 DNA的核糖核酸。

然后，将温度提高到95摄氏度，使酶失活。 最后，将细胞溶酶添加到由反应缓冲器、dNTP、前向和反向引物组成的多氯联苯主混合管中，用于感兴趣的区域、taq聚合酶和水，使反应达到所需的最终体积。要执行 PCR，请运行适当的热循环程序，以放大感兴趣的 DNA 区域。

在下列示例中，我们将看到 PCR 程序，以筛选单个 F1 蠕虫基因组 DNA 中的 CRISPR-Cas9 编辑事件。

- 在产卵1至2天后，使用蠕虫图片将F1转移到包含7微升热裂解缓冲器的单个PCR条状管帽中。 以最高速度和室温将PCR管离心一分钟，将动物带到管子底部。然后，将管子在负80摄氏度下冷冻一小时。

接下来，使用以下程序在热循环器中解冻冷冻蠕虫，然后按照此表所示设置 PCR 主组合。

将 21 微升 PCR主混合物加入干净的 PCR 管中，然后加入蠕虫裂解管的 4微升，通过管道混合良好。

然后，按照制造商的准则运行 PCR 程序。