Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Para el análisis pcr de un solo gusano, permita que un gusano hermafrodita se auto fertilize y lave huevos que producirán descendencia genéticamente idéntica y, por lo tanto, conserve una copia de la cepa modificada.
Congelar el tubo a menos 80 grados Centígrados para abrir la cutícula o la capa externa. Calienta la muestra a más de 60 grados centígrados para liar las células del gusano liberando las proteínas intracelulares junto con el ADN genómico de la célula. A esta temperatura, la proteína K dentro del tampón degrada las proteínas, particularmente las nucleasas que de otro modo destruirían el ADN genómico.
Luego, elevar la temperatura a 95 grados Celsius para inactivar la enzima. Finalmente, añadir el lisato celular a un tubo con una mezcla maestra PCR compuesta de amortiguador de reacción, dNTPs, imprimaciones hacia adelante y hacia atrás para la región de interés, taq polimerasa, y agua llevando la reacción a un volumen final deseado.
En el ejemplo siguiente, veremos un procedimiento PCR para detectar eventos de edición CRISPR-Cas9 en el ADN genómico de gusanos F1 individuales.
- Después de 1 a 2 días de puesta de huevos, utilice una foto de gusano para transferir los F1 en tapas individuales de tubo de tira PCR que contengan 7 microlitros de tampón de lisis caliente. Centrífuga los tubos PCR a máxima velocidad y temperatura ambiente durante un minuto para llevar a los animales al fondo del tubo.
A continuación, alice los gusanos congelados en un ciclor térmico utilizando el siguiente programa.
Añadir 21 microlitros de mezcla maestra PCR en tubos PCR limpios. Luego, añadir 4 microlitros del tubo de lisis gusano y mezclar bien por pipeteo.
A continuación, ejecute el programa PCR siguiendo las directrices del fabricante.
