Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Für die PCR-Analyse mit einem einzigen Wurm erlauben, dass ein Hermaphrodit-Wurm selbst befruchtet und Eier legt, die genetisch identische Nachkommen produzieren, und daher eine Kopie des modifizierten Stammes aufbewahren.
Einfrieren Sie die Röhre bei minus 80 Grad Celsius, um die Nagelhaut oder die äußere Schicht aufzubrechen. Erhitzen Sie die Probe auf plus 60 Grad Celsius, um die Wurmzellen, die die intrazellulären Proteine freisetzen, zusammen mit der genomischen DNA der Zelle zu lysieren. Bei dieser Temperatur degradiert die Proteinase K innerhalb des Puffers die Proteine, insbesondere Nukleasen, die sonst die genomische DNA zerstören würden.
Dann erhöhen Sie die Temperatur auf 95 Grad Celsius, um das Enzym zu inaktivieren. Schließlich fügen Sie das Zelllysat zu einem Rohr mit einem PCR-Master-Mix bestehend aus Reaktionspuffer, dNTPs, Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen für den Bereich von Interesse, Taq-Polymerase und Wasser, das die Reaktion auf ein gewünschtes Endvolumen bringt. Um die PCR durchzuführen, führen Sie das entsprechende thermische Cycler-Programm aus, das den DNA-Bereich von Interesse verstärkt.
Im folgenden Beispiel wird ein PCR-Verfahren angezeigt, um CRISPR-Cas9-Bearbeitungsereignisse in der genomischen DNA einzelner F1-Würmer zu überprüfen.
- Nach 1 bis 2 Tagen Eiablage, verwenden Sie ein Wurmbild, um die F1s in einzelne PCR-Streifenrohrkappen mit 7 Mikroliter warmer Lysepuffer zu übertragen. Zentrifugieren Sie die PCR-Röhren mit maximaler Geschwindigkeit und Raumtemperatur für eine Minute, um die Tiere auf den Boden des Rohres zu bringen. Dann frieren Sie die Rohre bei negativen 80 Grad Celsius für eine Stunde ein.
Anschließend lyse gefrorene Würmer in einem thermischen Cycler mit dem folgenden Programm. Richten Sie dann einen PCR-Master-Mix ein, wie in dieser Tabelle gezeigt.
Fügen Sie 21 Mikroliter PCR-Master-Mix in saubere PCR-Röhren. Dann fügen Sie 4 Mikroliter des Wurmlyserohrs und mischen Sie gut durch Pipettieren.
Führen Sie dann das PCR-Programm gemäß den Richtlinien des Herstellers aus.
