Drosofilia Optogenetica: un metodo per manipolare i circuiti neuronali

- Nelle mosche della Drosofilia, uno stimolo visivo incombente che segnala l'avvicinarsi di un predatore attiva circuiti neuronali che innescano una risposta di fuga. Per manipolare il circuito neuronale che controlla tale risposta, esprimere un'opsina transgenica sensibile alla luce, come channelrhodopsin-2 in specifici neuroni all'interno di quel circuito.

Channelrhodopsin è un canale di catione foto-sensibile che si apre quando esposto a una luce blu brillante. Il successivo afflusso di ioni di sodio aumenta un potenziale d'azione che fa sì che il neurone ritorti e relè le informazioni lungo il circuito. Oltre allo stimolo luminoso, il cofattore all-trans-retinale è necessario per l'apertura della channelrhodopsin.

Pertanto, fornire tutta la trans-retina nel cibo a mosca, poiché di solito è presente in quantità molto piccole. Inoltre, quando si studia il ruolo dei neuroni in un circuito neurale coinvolto in una risposta a uno stimolo visivo, utilizzare mosche visivamente cieche per prevenire altre risposte luminose.

Infine, usate una luce LED blu per innescare lo stesso comportamento causato dallo stimolo incombente. Nel protocollo di esempio, vedremo la preparazione del cibo e la risposta comportamentale indotta dalla luce delle mosche che esprimono la channelrhodopsina nei neuroni del lobo ottico.

- Iniziare sciogliendo il cibo di mosca di farina di mais standard in un forno a microonde e lasciarlo raffreddare fino a quando non è caldo al tatto. Una volta raffreddato, mescolare 50 microlitri di 20 millimolare completamente trans-retinica precedentemente preparati in ogni fiala. Quindi, lasciare raffreddare le fiale e tenersi protetti dalla luce fino a quando necessario.

In primo luogo, anestetizzare brevemente le mosche sul ghiaccio. Quindi, posizionare le singole mosche nelle punte delle pipette P1000 con la punta tagliata per formare un diametro dei pori di circa 2,25 millimetri e sigillare ciascuna estremità con il nastro. Una volta che la mosca si è svegliata ed è in fase di esplorazione della punta della pipetta, rimuovere il nastro e posizionare rapidamente la punta nella scanalatura nel supporto verticale. Fissare il chip in posizione con una vite per pollice, che chiude il fondo della punta.

Le mosche in genere esplorano la punta per un periodo compreso tra 30 e 60 secondi. Mentre la mosca si avvicina alla parte superiore della punta, avviare la registrazione della fotocamera appena prima che la mosca emerga sulla piattaforma. Dopo che la mosca è emersa sulla piattaforma, attendere da uno a due secondi e quindi accendere i LED blu. Utilizzare un timer per misurare manualmente il tempo fino a quando la mosca non avvia il volo.