Encyclopedia of Experiments: Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- I Drosophilia flyr en truende visuell stimulans som signaliserer tilnærmingen til en rovdyr aktiverer nevronale kretser som utløser en fluktrespons. For å manipulere nevronkretsen som styrer et slikt svar, uttrykke en transgen lysfølsom opsin, som channelrhodopsin-2 i spesifikke nevroner innenfor den kretsen.
Channelrhodopsin er en fotofølsom kationkanal som åpnes når den utsettes for sterkt blått lys. Den påfølgende tilstrømningen av natriumioner øker et handlingspotensial som får nevronen til å skyte og videresende informasjon langs kretsen. I tillegg til lysstimulansen er kofaktoren all-trans-retinal nødvendig for at channelrhodopsin skal åpne.
Derfor, gi all-trans-retinal i flymaten, siden den vanligvis er til stede i svært små mengder. I tillegg, når du undersøker nevronenes rolle i en nevral krets involvert i et svar på en visuell stimulans, bruk fluer som er visuelt blinde for å forhindre andre lysresponser.
Til slutt, bruk et blått LED-lys for å utløse den samme oppførselen som er forårsaket av den truende stimulansen. I eksempelprotokollen vil vi se matforberedelsen og lysindusert atferdsrespons av fluer som uttrykker channelrhodopsin i optiske lobe nevroner.
- Begynn med å smelte standard maismelfluemat i en mikrobølgeovn, og la den avkjøles til den er varm å berøre. Når du er avkjølt, bland 50 mikroliter tidligere tilberedt 20 millimolar all-trans-retinal i hvert hetteglass. La deretter hetteglassene avkjøles og hold de beskyttet mot lys til det er nødvendig.
Først må du kort bedøve fluene på isen. Plasser deretter individuelle fluer i P1000 pipettespisser med spisskuttet for å danne en porediameter på rundt 2,25 millimeter, og forsegle hver ende med tape. Når flyet er vekket og utforsker pipettespissen, fjern båndet og plasser spissen raskt i sporet i den vertikale holderen. Fest brikken på plass med en tommelskrue, som lukker bunnen av spissen.
Fluer utforsker vanligvis spissen i mellom 30 og 60 sekunder. Når flyet nærmer seg toppen av spissen, starter du kameraopptaket like før flyet kommer ut på plattformen. Etter at flyet har dukket opp på plattformen, vent ett til to sekunder, og slå deretter på de blå lysdiodene. Bruk en timer til å måle tiden manuelt til flyet starter flyvningen.
