C. elegans Test di sopravvivenza: un test di tossicità a breve termine

- Iniziare preparando il composto da testare per la tossicità e distribuirlo ai pozzi di una piastra di dosaggio. Trasferire i vermi dello stadio di sviluppo appropriato in ogni pozzo e avviare immediatamente un timer. Prendere nota di eventuali vermi danneggiati e non includerli nei calcoli di sopravvivenza.

Dopo un tempo predeterminato, contare il numero di vermi ancora vivi in ogni pozzo. La luce intensa di un microscopio a dissezione o di un delicato tocco sulla piastra dovrebbe causare lo spostamento di eventuali vermi vivi. Ripetere questa osservazione dopo ogni intervallo di tempo, fino a quando la maggior parte degli animali non è morta. Nel protocollo seguente osserveremo il tempo di sopravvivenza delle larve L4 durante l'esposizione al paraquat, un composto che induce stress ossidativo.

- In questa dimostrazione, lo stress ossidativo sarà indotto utilizzando paraquat. Preparare una soluzione paraquata fresca da 100 millimolare come descritto nel testo del protocollo di accompagnamento. Paraquat è un composto pericoloso e altamente tossico e deve essere maneggiato secondo le linee guida appropriate.

Pipetta 40 microlitri della soluzione paraquata in ogni pozzo di una piastra da 96 pozzetti. Utilizzare almeno 12 pozzi come repliche di ogni condizione testata. Utilizzando un piccone di verme filo di platino, trasferire da cinque a otto animali larve L4 in ogni pozzo.

Indicare l'ora di inizio e l'ora di fine per ogni condizione testata. Posizionare la piastra da 96 pozzi a 20 gradi Celsius. Un'ora dopo l'ora di inizio, segnare animali morti e vivi utilizzando un microscopio sezionato. Scuotere delicatamente la piastra prima di iniziare a contare.

I vermi che non si muovono anche dopo aver avvistare una luce ad alta intensità vengono segnati come morti. Guardate la forma del verme, le code e il movimento della testa ad alto ingrandimento per distinguere i vermi morti dai vermi vivi. Segnate la sopravvivenza ogni ora fino a quando la maggior parte dei vermi non è morta e ripetete questo saggio almeno tre volte indipendenti.

Per determinare la percentuale di sopravvivenza per ogni punto di tempo, calcolare innanzitutto il numero totale di animali per condizione aggiungendo il numero totale di animali trasferiti a ciascun pozzo. Ignorare gli animali danneggiati o uccisi al momento del trasferimento. Successivamente, per ogni punto di tempo, calcolare il numero totale di animali morti per condizione. Calcolare la percentuale di morte e la percentuale di sopravvivenza.