C. elegans Bewegingstracking: een methode om voortbeweging in wormen te beoordelen

- Om de voortbeweging in C. elegans te beoordelen, gebruikt u een camera om de beweging van de wormen op een agarplaat vast te leggen, waardoor de plaat tijdens de opname gelijkmatig wordt verlicht. Om de beweging van de wormen rond de plaat te beperken, gebruikt u koperen ringen. Koper is aversief voor C. elegans, dus wormen worden in de ringen gecorreleerd.

Plaats meerdere koperen ringen op één plaat om tegelijkertijd wormen in elke ring te volgen. Dit maakt het mogelijk om de controle en proefdieren onder identieke omstandigheden uit te voeren, waardoor de dagelijkse variabiliteit wordt verminderd en vergelijkingen naast elkaar mogelijk zijn. Registreer de beweging van de wormen over ingestelde tijdsintervallen en gebruik computersoftware om kenmerken van het gedrag van de locomotief te analyseren, zoals de snelheid van de beweging en de afgelegde afstand.

In het voorbeeldprotocol zullen we een demonstratie zien van een bewegingsvolgtest die de effecten van alcohol op de voortbewegingssnelheid van de worm test.

- Om te beginnen, neem twee minuten of minder om 10 wormen over te brengen van elke experimentele groep naar het midden van een koperen ring op een acclimatisatieplaat. Dit is een plaat zonder ethanol. Vermijd het overbrengen van voedsel met de wormen, omdat het hun beweging zal verminderen. Vermijd ook het beschadigen van het agaroppervlak omdat de wormen zullen graven. Noteer de tijd van laden op de plaat en zorg ervoor dat de overdracht van wormen naar elke plaat met meer dan twee minuten wordt gespreid, zodat elke plaat afzonderlijk kan worden gefilmd op het juiste tijdsinterval.

Laat elke acclimatisatieplaat 30 minuten op kamertemperatuur incuberen. Breng vervolgens de wormen over naar de testplaat, volgens de volgorde die wordt gebruikt om de wormen op de acclimatisatieplaat te plaatsen. Verzamel de wormen met behulp van een dungerande afgeplatte wormpriem zonder bacteriën op de bovenkant van de afgeplatte plectrum met behulp van een schepbeweging. Sluit de plaat vervolgens af met laboratoriumfolie om het verlies van ethanol aan verdamping te minimaliseren.

- De snelheid waarmee de dieren in deze stap worden overgedragen is erg belangrijk, omdat de overgedragen dieren langer aan ethanol worden blootgesteld. Het is dus een goed idee om te draaien welke stammen eerst op de plaat worden geplaatst over experimentele replica's.

- Een microscoop met hoge resolutie videocamera is nodig om de wormen nu te filmen. Zelfs verlichting, zoals van een vierkante achtergrondverlichting van drie inch, is essentieel voor de analyse. Om het contrast te behouden, beeldt u vervolgens de kant van de plaatmedia naar boven.

Bereid de beeldanalysesoftware voor om 120 frame-, 12-bits, grijswaarden- en time-lapse-films in één frame per seconde vast te leggen. Om de grootte van het uitvoerbestand te verkleinen, terwijl u toch voldoende beeldresolutie behoudt, gebruikt u een twee-bij-twee binning-modus.

Neem nu twee minuten films op van elke plaat, 10 minuten nadat de laatste wormen op die plaat zijn geplaatst. Maak vervolgens een tweede opname van twee minuten, 30 minuten nadat wormen op de plaat zijn geplaatst. Voor deze demonstratie wordt Image-Pro Plus-software gebruikt, omdat een breed scala aan andere software kan worden aangepast aan de techniek. Analyseer de films als segmenten van twee minuten.

Pas eerst een filter toe op de afbeeldingen die de achtergrond afvlakken en het contrast van de wormobjecten verbeteren. Selecteer in het menu Proces, vervolgens Filters, vervolgens Verbetering en vervolgens Afvlakken. Stel de parameter in voor een donkere achtergrond en een breedte van 20 Pix-objecten.

Analyseer nu de voortbeweging van de dieren in elke ring afzonderlijk met een cirkelvormig interessegebied dat de koperen ring overlapt. Identificeer en volg de wormen met de opdracht Objecten volgen onder het submenu Meten.

Gebruik in het venster Trackinggegevenstabel de knop Trackingopties om specifieke tracks uit te sluiten en experimentele artefacten te beperken. Stel onder het tabblad Automatische tracking de spoorparameters in op een snelheidslimiet van 400 micron per frame. Stel de versnellingslimiet in op Automatisch.

Stel de minimale totale spoorlengte in op 400 micron en stel het overheersende bewegingstype in op Chaotisch. Stel vervolgens onder de parameter Track de objecten in zodat gedeeltelijke tracks een minimale lengte van 21 frames hebben en een projectiediepte van één frame.

Om het trackingproces te starten, klikt u eerst op de functie Knop Alle tracks automatisch zoeken. Hiermee opent u het dialoogvenster Opties voor aantal/grootte en het dialoogvenster Bijhouden. Selecteer de optie Handmatig voor de selectie van het intensiteitsbereik in het dialoogvenster Aantal/grootte. Dit biedt een belangrijke drempelstap. Vervolgens past u de schuifregelaars Intensiteitsdrempel aan om een inclusief bereik te maken dat donkere objecten markeert. Een goed beginpunt op de schaal ligt tussen 0 en 1.500.

Pas nu een groottefilter toe om objecten uit te sluiten die groter of kleiner zijn dan één worm. Ga naar het menu Meten en selecteer vervolgens het submenu Meting. Hiermee opent u het dialoogvenster Opties tellen/grootte. Stel daar het gebiedsbereik in op 28.000 tot 120.000 vierkante micron. En stel het omtrekbereik in op 600 tot 2.500 micron. Pas deze parameters aan bij het gebruik van wormen van abnormale grootte.

Voltooi nu het trackingproces door te klikken op Doorgaan in het dialoogvenster Tracking. Controleer nogmaals of de uitvoer wordt bijgesloten met de filmbeelden. Zorg ervoor dat elke worm wordt weergegeven, tenzij er een duidelijke reden is om deze te filteren. Verwijder vervolgens handmatig tracks die zijn geproduceerd door niet-wormobjecten.

Bereken vervolgens de snelheid van elke worm door de afgelegde afstand tussen elk frame of elke seconde te gemiddelden en maak een gemiddelde snelheid voor de sporen in elke populatie. Beschouw dit uiteindelijke gemiddelde als één voorbeeldpunt voor statistische analyse van het experiment.