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C. elegans Suivi des mouvements

 
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C. elegans Suivi des mouvements : une méthode pour évaluer la locomotion chez les vers

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- Pour évaluer la locomotion chez C. elegans, utilisez une caméra pour enregistrer le mouvement des vers sur une plaque d’agar, assurant même l’éclairage de la plaque pendant l’enregistrement. Pour limiter le mouvement des vers autour de la plaque, utilisez des anneaux de cuivre. Le cuivre est aversif pour C. elegans, de sorte que les vers sont corralled dans les anneaux.

Placez plusieurs anneaux de cuivre sur une plaque pour suivre simultanément les vers dans chaque anneau. Cela permet d’évaluer les animaux témoins et expérimentaux dans des conditions identiques, de réduire la variabilité quotidienne et de permettre des comparaisons côte à côte. Enregistrez le mouvement des vers sur des intervalles de temps définis, et utilisez un logiciel pour analyser les caractéristiques du comportement de la locomotive, telles que la vitesse de déplacement et la distance parcourue.

Dans le protocole de l’exemple, nous verrons une démonstration d’un test de suivi des mouvements testant les effets de l’alcool sur la vitesse de locomotion du ver.

- Pour commencer, prendre deux minutes ou moins pour transférer 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d’un anneau de cuivre sur une plaque d’acclimation. Il s’agit d’une plaque sans éthanol. Évitez de transférer les aliments avec les vers, car cela réduira leur mouvement. Évitez également d’endommager la surface de l’agar parce que les vers creuseront. Enregistrez le temps de chargement sur la plaque et assurez-vous de échelonner le transfert de vers à chaque plaque de plus de deux minutes, de sorte que chaque plaque peut être filmée individuellement à l’intervalle de temps approprié.

Laissez chaque plaque d’aclimation couver à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, transférez les vers à la plaque d’essai, suivant l’ordre utilisé pour placer les vers sur la plaque d’acclimation. À l’aide d’un pic de ver aplati à bords minces sans bactéries, recueillez les vers sur le dessus de la pioche aplatie à l’aide d’un mouvement de ramassage. Puis, sceller la plaque avec un film de laboratoire pour minimiser la perte d’éthanol à la vaporisation.

- La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très importante, car les animaux transférés seront exposés à l’éthanol plus longtemps. Il est donc bon de faire pivoter les souches qui sont placées sur la plaque en premier à travers des répliques expérimentales.

- Un microscope avec caméra vidéo haute résolution est nécessaire pour filmer les vers maintenant. Même l’éclairage, comme à partir d’un rétro-éclairage carré de trois pouces, est essentiel pour l’analyse. Puis, pour maintenir le contraste, l’image du côté du média de la plaque vers le haut.

Préparez le logiciel d’analyse d’images pour capturer des films de 120 images, 12 bits, gris, time-lapse en un cadre par seconde. Pour réduire la taille du fichier de sortie, tout en conservant une résolution d’image suffisante, utilisez un mode binning deux par deux.

Enregistrez maintenant des films de deux minutes à partir de chaque assiette, 10 minutes après que les derniers vers ont été placés sur cette plaque. Puis faites un deuxième enregistrement de deux minutes, 30 minutes après que des vers ont été placés sur la plaque. Pour cette démonstration, le logiciel Image-Pro Plus est utilisé, car une grande variété d’autres logiciels peuvent être adaptés à la technique. Analyser les films sous forme de segments de deux minutes.

Appliquez d’abord un filtre sur les images qui aplatissent l’arrière-plan et améliorent le contraste des objets ver. Sous le menu, sélectionnez Processus, puis Filtres, puis Amélioration, puis Aplatissez. Définissez le paramètre pour un fond sombre et une largeur de fonctionnalité de 20 Pix.

Maintenant, analyser la locomotion des animaux dans chaque anneau séparément avec une région circulaire d’intérêt qui chevauche l’anneau de cuivre. Identifier et suivre les vers avec la commande d’objets de voie sous le sous-menu Mesure.

Dans la fenêtre Table de données de suivi, utilisez le bouton Options de suivi pour permettre l’exclusion de pistes spécifiques et pour limiter les artefacts expérimentaux. Sous l’onglet Suivi automatique, définissez les paramètres de la voie à une limite de vitesse de 400 microns par image. Définissez la limite d’accélération à automatique.

Réglez la longueur totale minimale de la voie à 400 microns, et réglez le type de mouvement prédominant à chaotique. Puis sous le paramètre de piste, réglez les objets pour permettre aux pistes partielles d’avoir une longueur minimale de 21 images et d’avoir une profondeur de projection de suivi d’un cadre.

Maintenant, pour lancer le processus de suivi, cliquez d’abord sur le bouton de fonction Trouver toutes les pistes automatiquement. Cela fait ressortir la boîte de dialogue Count/Size Options et la boîte de dialogue de suivi. Sélectionnez l’option Manuel pour la sélection de plage d’intensité dans la boîte de dialogue Count/Size. Cela fournit une étape de seuil importante. Puis ajuste les curseurs seuil d’intensité pour créer une plage inclusive qui met en évidence les objets sombres. Un bon point de départ sur l’échelle se situe entre 0 et 1 500.

Appliquez maintenant un filtre de taille pour exclure les objets plus grands ou plus petits qu’un seul ver. Allez au menu Mesure, puis sélectionnez le sous-menu mesure. Cela ouvre la boîte de dialogue d’options Count/Size. Là, réglez la plage de surface à 28 000 à 120 000 microns carrés. Et réglez la plage de périmètre à 600 à 2 500 microns. Faites des ajustements à ces paramètres lorsque vous utilisez des vers de taille anormale.

Maintenant, complétez le processus de suivi en cliquant continuer dans la boîte de dialogue de suivi. Vérifiez que la sortie suit avec les séquences de film. Assurez-vous que chaque ver est représenté à moins qu’il n’y ait une raison claire de le filtrer. Puis, supprimer manuellement les pistes produites par des objets non vermifuges.

Ensuite, calculez la vitesse de chaque ver en faisant la moyenne de la distance parcourue entre chaque image ou chaque seconde, et créez une vitesse moyenne pour les pistes de chaque population. Considérez cette moyenne finale comme un point d’échantillon pour l’analyse statistique de l’expérience.

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