C. elegans Tracciamento del movimento: un metodo per valutare la locomozione nei vermi

- Per valutare la locomozione in C. elegans, utilizzare una telecamera per registrare il movimento dei vermi su una piastra di agar, garantendo un'illuminazione uniforme della piastra durante la registrazione. Per limitare il movimento dei vermi intorno alla piastra, utilizzare anelli di rame. Il rame è avverso a C. elegans, quindi i vermi sono recinto all'interno degli anelli.

Posizionare diversi anelli di rame su una piastra per tracciare simultaneamente i vermi in ogni anello. Ciò consente di eseguire la valutazione del controllo e degli animali da esperimento in condizioni identiche, riducendo la variabilità quotidiana e consentendo confronti fianco a fianco. Registrare il movimento dei worm su intervalli di tempo impostati e utilizzare il software del computer per analizzare le caratteristiche del comportamento della locomotiva, ad esempio la velocità di movimento e la distanza percorsa.

Nel protocollo di esempio, vedremo una dimostrazione di un test di tracciamento del movimento che testa gli effetti dell'alcol sulla velocità di locomozione del verme.

- Per iniziare, prendere due minuti o meno per trasferire 10 vermi da ogni gruppo sperimentale al centro di un anello di rame su una piastra di acclimatazione. Si tratta di un piatto senza etanolo. Evitare di trasferire cibo con i vermi in quanto ridurrà il loro movimento. Evitare anche di danneggiare la superficie dell'agar perché i vermi scavano. Registrare il tempo di caricamento sulla piastra e assicurarsi di scaglionare il trasferimento dei vermi su ogni piastra di oltre due minuti, in modo che ogni piastra possa essere filmata singolarmente all'intervallo di tempo appropriato.

Lasciare incubare ogni piastra di acclimatazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, trasferire i vermi nella piastra di dosaggio, seguendo l'ordine utilizzato per posizionare i vermi sulla piastra di acclimatazione. Utilizzando un piccone di vermi appiattito dai bordi sottili senza batteri, raccogliere i vermi sopra il piccone appiattito utilizzando un movimento di raccolta. Quindi, sigillare la piastra con pellicola di laboratorio per ridurre al minimo la perdita di etanolo a vaporizzazione.

- La velocità con cui gli animali vengono trasferiti in questa fase è molto importante, perché gli animali trasferiti saranno esposti all'etanolo più a lungo. Quindi è una buona idea ruotare quali ceppi vengono posizionati prima sulla piastra attraverso repliche sperimentali.

- Per l'analisi è necessario un microscopio con videocamera ad alta risoluzione per filmare i vermi. Anche l'illuminazione, ad esempio da una retroilluminazione quadrata da tre pollici, è fondamentale per l'analisi. Quindi, per mantenere il contrasto, mantenere il lato del supporto della piastra verso l'alto.

Preparare il software di analisi delle immagini per acquisire filmati a 120 fotogrammi, 12 bit, scala di grigi e time-lapse in un fotogramma al secondo. Per ridurre le dimensioni del file di output, pur mantenendo una risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizzare una modalità binning due per due.

Ora registra i filmati di due minuti da ogni piatto, 10 minuti dopo che gli ultimi worm sono stati posizionati su quella lastra. Quindi effettuare una seconda registrazione di due minuti, 30 minuti dopo che i worm sono stati posizionati sulla piastra. Per questa dimostrazione viene utilizzato il software Image-Pro Plus, poiché un'ampia varietà di altri software può essere adattata alla tecnica. Analizza i film come segmenti di due minuti.

Applicare innanzitutto un filtro alle immagini che appiattisce lo sfondo e migliora il contrasto degli oggetti worm. Nel menu selezionare Processo, quindi Filtri, quindi Miglioramento, quindi Appiattire il parametro per uno sfondo scuro e una larghezza della feature 20 Pix.

Ora, analizzate la locomozione degli animali in ogni anello separatamente con una regione circolare di interesse che si sovrappone all'anello di rame. Identificate e tracciate i vermi con il comando Traccia oggetti (Track Objects) del sottoprogramma Misura (Measure).

Nella finestra Tabella dati di tracciamento, utilizzate il pulsante Opzioni tracciabilità (Tracking Options) per consentire l&;esclusione di tracce specifiche e per limitare eventuali artefatti sperimentali. Nella scheda Rilevamento automatico (Auto Tracking), impostate i parametri della traccia su un limite di velocità di 400 micron per fotogramma. Impostate il limite di accelerazione su Automatico (Automatic).

Impostate la lunghezza minima totale della traccia su 400 micron e impostate il tipo di movimento predominante su Caotico. Quindi, sotto il parametro Track, impostate gli oggetti in modo che consentano alle tracce parziali di avere una lunghezza minima di 21 fotogrammi e di avere una profondità di proiezione di tracciamento di un fotogramma.

A questo punto, per avviare il processo di rilevamento, fare clic sul pulsante Trova tutte le tracce automaticamente. In questo modo vengono visualizzata la finestra di dialogo Opzioni conteggio/dimensione e la finestra di dialogo Rilevamento. Selezionare l'opzione Manuale per la selezione dell'intervallo di intensità nella finestra di dialogo Conteggio/Dimensione. Questo fornisce un passaggio di soglia importante. Quindi regola i dispositivi di scorrimento Soglia intensità per creare un intervallo inclusivo che evidenzia gli oggetti scuri. Un buon punto di partenza sulla scala è compreso tra 0 e 1.500.

Applicare ora un filtro dimensioni per escludere gli oggetti più grandi o più piccoli di un singolo worm. Passare al menu Misura, quindi selezionare Sottonome Misurazione. Viene visualizzata la finestra di dialogo Opzioni Conteggio/Dimensione. Immettere l'intervallo di aree su 28.000 a 120.000 micron quadrati. E impostare l'intervallo perimetrale su 600 a 2.500 micron. Apportare modifiche a questi parametri quando si utilizzano worm di dimensioni anomale.

A questo punto, completate il processo di rilevamento facendo clic su Continua (Continue) nella finestra di dialogo di rilevamento. Ricontrollate che l'output venga tracciato con il metraggio del filmato. Assicurarsi che ogni worm sia rappresentato a meno che non vi sia un motivo chiaro per filtrarlo. Eliminare manualmente le tracce prodotte da oggetti non worm.

Successivamente, calcolate la velocità di ogni verme calcolando la media della distanza percorsa tra ogni fotogramma o ogni secondo e create una velocità media per le tracce in ogni popolazione. Si consideri questa media finale come un punto campione per l'analisi statistica dell'esperimento.