Microscopia corneale confocale: A Novel tecnica non invasiva per quantificare Piccole Fibre Patologia neuropatie periferiche

Questo video mostra una procedura per l'imaging delle fibre C corneali utilizzando la tecnica non invasiva della microscopia confocale corneale o CCM che consente di quantificare il danno alle fibre nervose. Innanzitutto, il piano focale della lente sul CCM viene regolato e il gel lacrimale visco viene applicato sulla lente prima di montare il cappuccio monouso. Gocce anestetiche e gel lacrimale visco vengono quindi applicati sull'occhio.

Successivamente, la telecamera viene regolata in modo da entrare in contatto tra il gel sulla parte anteriore della lente e la cornea del paziente. Infine, la profondità del piano di messa a fuoco viene regolata e vengono catturate le immagini dei nervi corneali dalla parte centrale dello strato di Bowman. Cambiamenti morfologici nelle fibre nervose corneali possono essere osservati a quantificare la neuropatia.

Si tratta di una tecnica molto nuova che in realtà è stata precedentemente utilizzata nel mondo dell'optometria e dell'oftalmologia, ma negli ultimi otto anni circa, l'abbiamo utilizzata in modo molto efficace per studiare e valutare la neuropatia diabetica e altre neuropatie periferiche. E il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di quantificare il danno alle piccole fibre in una fase molto precoce, e quindi di stratificare la gravità della neuropatia nei pazienti in modo completamente non invasivo, e possiamo farlo molto rapidamente con una scansione di due minuti, che può quindi essere quantificata in termini di gravità della neuropatia e quindi speriamo che questo sostituisca alcune delle altre tecniche molto più invasive come la pelle biopsia e biopsia nervosa. Anche se nel complesso sembra una tecnica semplice, in realtà richiede passaggi precisi con cui si cattura l'immagine in modo ottimale e poi si quantifica l'immagine.

E vogliamo davvero rendere l'intero processo chiaro e evidente a chiunque altro possa desiderare di utilizzare questa tecnica. La fase iniziale dell'esame con il microscopio confocale corneale HRT è la preparazione della punta della lente dell'obiettivo sul tubo dell'obiettivo della telecamera a scansione laser. Impostare la rifrazione su più 12 diottrie, quindi regolare la fotocamera nella posizione più bassa e bloccare l'obiettivo ruotandolo in senso antiorario.

Applicare una goccia di visco tears di dimensioni P grandi e omogenee e senza bolle sulla punta della lente. Rimuovere un tappo tomo dal suo contenitore sterile e montarlo sulla punta della lente il più possibile sopra il supporto, in modo che il gel formi un menisco tra la lente dell'obiettivo e il cappuccio. Fare attenzione a non toccare la superficie anteriore del tappo tomo durante il montaggio.

Ora, sposta la telecamera a scansione laser il più indietro possibile sulla superficie interna ed esterna del supporto della fotocamera. Entrambi appaiono come un riflesso laser luminoso sul monitor. Regolare la rotella di regolazione del piano focale fino a quando non si osserva un riflesso luminoso, che indica che l'obiettivo è messo a fuoco all'interno della parte anteriore del cappuccio.

Il valore di profondità mostrato nel display della posizione di messa a fuoco dovrebbe ora essere compreso tra meno 150 micrometri e più 150 micrometri. Reimpostate l'impostazione della profondità su zero. Vediamo ora come preparare il paziente.

Dopo aver anestetizzato gli occhi del soggetto con la goccia di cloridrato allo 0,4%, lubrificare la parte anteriore dell'occhio con lacrime viscose. Guarda il soggetto comodamente con il mento sulla mentoniera, assicurandoti che la fronte sia premuta saldamente contro la barra frontale. L'esame è facilitato dall'istruzione al paziente di fissarsi sulla luce di fissazione esterna.

Con l'occhio che non viene esaminato, le dimensioni compatte della testa del microscopio assicurano che l'occhio controlaterale del soggetto non sia oscurato. Abilitazione dell'uso di bersagli a distanza. Posizionare la telecamera CCD in modo che il suo accesso ottico sia perpendicolare all'accesso ottico della telecamera a scansione laser.

La telecamera deve essere posizionata sul lato destro del paziente durante l'imaging dell'occhio destro e viceversa. In questa posizione, la superficie anteriore del tomo cap è visibile al centro della telecamera CCD. Immagine dal vivo.

Spostare la telecamera a scansione laser verso il paziente fino a quando la cornea del paziente non si trova a una distanza di circa 5-10 millimetri dal cappuccio del tomo. Quindi utilizzare le manopole di regolazione dell'accesso verticale e orizzontale sul supporto della fotocamera per spostare la fotocamera a scansione laser su e giù e a sinistra e a destra fino a quando il cappuccio tomo non è posizionato al centro della cornea del paziente. Ora chiedi al paziente di spalancare gli occhi il più possibile.

Spostare lentamente la telecamera a scansione laser verso il paziente fino a quando il cappuccio del tomo non tocca la cornea del paziente. In questa fase, verificare che la luce laser rossa si trovi al centro della cornea e che la riflessione del raggio laser dalla cornea avvenga esattamente al polo anteriore della cornea. Il contatto tra la lente e la cornea è minimo con una regolazione ottimale.

Un sottile ponte in gel tra il cappuccio tomo e la cornea è visibile nell'immagine dal vivo della telecamera CCD. Se c'è troppa pressione tra il cappuccio tomo e la cornea, si verifica un aspetto appiattito nella cornea tramite la telecamera CCD. L'immagine dal vivo e il randagio vengono visualizzati sull'immagine CCM.

Dopo aver regolato il paziente, accendere la telecamera laser HR three, sullo schermo apparirà la finestra di acquisizione delle immagini. Utilizzare l'immagine CCD per posizionare la calotta tomo e la luce laser sulla cornea del paziente. Il CCM dispone di tre opzioni per l'acquisizione delle immagini.

La scansione in sequenza consente di acquisire fino a 100 immagini con un frame rate regolabile. Viene selezionata una frequenza fotogrammi compresa tra 30 e un fotogramma al secondo. E sulla base di ciò, è possibile acquisire un film con una durata da tre a 100 secondi.

Nella modalità di scansione del volume, la fotocamera acquisisce automaticamente una serie di 40 immagini su piani focali consecutivi. È possibile scansionare una profondità totale di 85 micrometri e la distanza focale tra due immagini consecutive è di circa 2,1 micrometri. L'ultima opzione è la modalità sezione, che verrà utilizzata per questo esperimento.

Questa modalità consente di ottenere immagini ottimali con immagini singole nitide acquisite e memorizzate ogni volta che si preme l'interruttore a pedale. Questa modalità viene utilizzata per acquisire immagini dall'intero strato corneale, incluso lo strato di Bowman al centro della cornea. Dopo aver acquisito un numero sufficiente di immagini, è possibile utilizzare altre modalità, tra cui sequenza e volume.

Dopo alcune scansioni, il piano focale della lente può essere modificato per misurare la profondità di uno strato di cellule corneali rispetto alla superficie corneale mettendo a fuoco lo strato di cellule epiteliali e quindi facendo clic sul pulsante di ripristino per impostare il valore di profondità su zero. Al termine dell'esame, spegnere la fotocamera facendo clic sul pulsante di accensione della fotocamera nella finestra di acquisizione. Rendere il paziente consapevole che non deve strofinarsi gli occhi fino a quando l'anestesia locale non è svanita.

Rimuovere il tappo tomo dalla fotocamera, smaltirlo, quindi pulire l'obiettivo del microscopio con un batuffolo di cotone inumidito con acqua distillata. Vediamo ora come analizzare un'immagine e quantificare i parametri delle fibre nervose per rivedere e analizzare gli esami esistenti. Innanzitutto, selezionare la cartella clinica appropriata nella finestra del database.

La finestra di visualizzazione delle immagini fornisce una panoramica degli esami della cornea esistenti per il paziente selezionato Gli esami eseguiti in giorni diversi sono memorizzati in schede di visita separate. I tre diversi tipi di scansione sono rappresentati da tre icone diverse. Nella scheda di visita della cornea HRT tre della finestra di visualizzazione delle immagini dell'Heidelberg Eye Explorer.

Per esaminare l'immagine della cornea, fare doppio clic sull'icona dell'immagine appropriata e quindi premere Mostra ora per esportare le immagini appropriate per ulteriori analisi, fare clic su Esporta sulla barra degli strumenti e quindi selezionare la cartella in cui salvare le immagini. Poiché l'obiettivo principale di questa ricerca è lo strato di Bowman e i nervi corneali, verranno analizzate solo le immagini di questo strato. Da cinque a sei fotogrammi dello strato di Bowman vengono selezionati per ogni soggetto a diverse profondità della cornea.

L'analisi delle immagini viene condotta con un software specializzato sviluppato dal nostro gruppo chiamato CCM Image Analysis Tools, versione 0.64. I parametri principali per i nervi corneali vengono misurati con la densità delle fibre nervose software, che è definita come il numero di nervi principali per fotogramma. La densità dei rami nervosi è il numero totale di rami principali per fotogramma.

La lunghezza delle fibre nervose è la lunghezza totale dei nervi principali e dei rami principali per telaio. La tortuosità è la tortuosità dei nervi principali per fotogramma. Per aprire un'immagine CCM, accedere al file e quindi aprirlo.

Una volta caricata l'immagine, le sue dimensioni e il suo tipo vengono visualizzati nella casella delle informazioni sull'immagine in alto a sinistra del pannello di controllo, la scala predefinita viene visualizzata nella riga di modifica delle informazioni sull'immagine. Se la scala è diversa, modificare il numero nella riga di modifica. Per iniziare ad analizzare l'immagine, selezionare il parametro che si desidera misurare dalla casella metrica nella parte in alto a destra del pannello di controllo.

Nella casella dei risultati in fondo alla pagina, NFD e MBD sono presentati come numeri effettivi. La NFL è presentata in millimetri e la tortuosità come coefficiente di tortuosità. I risultati possono essere esportati in un foglio Excel.

Quando apri la pagina Excel, i risultati verranno presentati in numero per millimetro al quadrato per NFD e MBD, millimetri per millimetro al quadrato per NFL e coefficiente di tortuosità per NFT. Per effettuare queste misurazioni, inizia contrassegnando ogni nervo principale, quindi contrassegna ogni ramo nervoso principale. Infine, traccia ogni nervo nell'inquadratura.

Per una migliore precisione è possibile utilizzare una penna digitale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un minuto se viene eseguita correttamente durante il tentativo di questa procedura. È importante seguire le istruzioni dettagliate.

Dopo aver visto questo video, speriamo che tu abbia una buona comprensione di come lavorare e acquisire immagini dallo strato di movimento della cornea con la microscopia confocale corneale e quantificare e analizzare le immagini da questo strato in pazienti con neuropatia periferica, in particolare neuropatia diabetica. E non dimenticare che lavorare con la CCM richiede esperienza ed è stato consigliato che i professionisti formati nell'esame oculistico dovrebbero intraprendere la procedura.