Iperinsulinemico-euglicemico pinza nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la sensibilità all'insulina nel ratto cosciente e non trattenuto. Ciò si ottiene con il primo cateterizzazione dell'arteria carotide sinistra. Successivamente, la vena giugulare destra viene cateterizzata per garantire risultati ottimali.

I cateteri vengono lavati quotidianamente per mantenere la pervietà durante un periodo di recupero postoperatorio di cinque giorni. In definitiva, i risultati possono essere ottenuti dal morsetto glicemico iperinsulinemico U che mostra le velocità di infusione del glucosio in tutto il corpo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è possibile ottenere misurazioni dirette dei tassi di smaltimento del glucosio in tutto il corpo ad alti livelli fisiologici di insulina.

I cateteri arteriosi e venosi devono essere preparati prima della procedura chirurgica. Il catetere deve avere le estremità smussate, essere riempito con soluzione fisiologica eparinizzata ed essere sterilizzato con etanolo con un battito di contenimento fissato saldamente a 2,7 o 3,2 centimetri da un'estremità rispettivamente per i cateteri arteriosi e venosi. In questa procedura vengono utilizzati ratti maschi adulti di circa 300 grammi.

Registra il peso iniziale dell'animale e usa questo peso per monitorare l'aumento di peso post-operatorio. Lavorare in un'area chirurgica asettica. Anestetizzare il ratto con il 3% di fluoro mettendolo in una scatola di anestetico.

Trasferire l'animale lontano dall'area chirurgica e preparare il sito di incisione rimuovendo i peli intorno al collo e alle spalle. Una volta rimossi i peli, posizionare l'animale in un cono nasale per mantenere l'anestesia con circa il 2% di fluoro. Fissare l'animale al tavolo operatorio.

Assicurarsi che il ratto sia completamente anestetizzato controllando la presenza di riflessi del piede e/o dell'occhio. Pulire il sito di incisione con etanolo al 70%, seguito da uno scrub Betadine e seguito nuovamente da etanolo al 70%. Il primo passo della procedura consiste nel praticare una piccola incisione verticale della linea mediana di 10 millimetri superiore allo sterno.

Utilizzare una pinza da micro dissezione curva per sezionare il tessuto ed esporre il muscolo mastoideo sternale sinistro. Rifletti questo muscolo per rivelare circa un centimetro dell'arteria carotide sinistra. Posiziona una pinza per micro dissezione sotto l'arteria carotide per tenerla in posizione mentre stuzzica delicatamente il tessuto connettivo.

È importante isolare il nervo vago lontano dall'arteria senza danneggiare né l'arteria né il nervo. Utilizzare una sutura di seta sterile da quattro oh per legare l'estremità cefalica. Bloccare il recipiente con una pinza da microdissezione seghettata.

Forare il legato. Termina con un adattatore per esche per campioni multis da 21 gauge. Rimuovere il tappo in acciaio inossidabile dal catetere e utilizzare un introduttore di catetere sterile per guidare nell'arteria.

Utilizzare una pinza per garantire che il catetere sia sicuro. Parzialmente. Rilasciare la pinza per micro dissezione, bloccando l'arteria e continuare a inserire il catetere fino al cordone. A questo punto, la punta del catetere dovrebbe essere nell'arco aortico.

Fissare due punti di sutura sotto la perlina e una sopra e lavare la linea con 10 unità per millilitro di soluzione salina eparinizzata. Per confermare che il catetere eseguirà il campionamento, ricollegare l'estremità esterna del catetere con un tappo in acciaio inossidabile. Per esporre la vena giugulare esterna destra, isolare accuratamente la vena e legare il cefalico.

Terminare con sutura di seta. Perforare la vena con una vena calibro 21. Espellere l'adattatore per esche multis.

Rimuovere il tappo in acciaio inossidabile dal catetere e utilizzare un introduttore di catetere sterile per inserirlo fino al cordone. Fissare due punti di sutura sotto il tallone e uno sopra. E lavare la linea con 10 unità per millilitro di soluzione salina di ghiaccio con eparina.

Per confermare che il catetere eseguirà il campionamento, ricollegare l'estremità esterna del catetere con un tappo in acciaio inossidabile utilizzando un tunnel dell'ago smussato calibro 14 sotto la pelle e praticare un'incisione nella parte posteriore tra le scapole. Quindi, infilare i cateteri attraverso l'ago in modo che escano dalla parte posteriore del ratto. Dovrebbero essere visibili circa quattro centimetri di ciascun catetere.

Tagliare 0,5 centimetri di tubo medico Tigon S 50 HL e posizionarlo attorno a entrambi i cateteri esterni. Fissare con nastro blu per le vene e rosso per le arterie. Ripetere il test dei cateteri per garantire la pervietà, quindi lavare e riempire con 150 unità per millilitro di soluzione salina eparinizzata per prevenire la coagulazione.

Chiudere tutte le incisioni con tre suture di seta. Metti il ratto in posizione prona in una gabbia pulita preavvertita con cibo facilmente accessibile. Una volta che il ratto riacquista la piena capacità deambulatoria e la vigilanza, rimettilo nella gabbia di casa.

Consentire al ratto di riprendersi per tre-cinque giorni monitorando quotidianamente infezioni, dolore e cambiamenti di peso. È importante che la pervietà del catetere sia mantenuta per tutta la durata dello studio. Ogni giorno dopo l'intervento chirurgico, riempire siringhe da un millilitro con soluzione salina eparinizzata da 150 unità per millilitro e tapparle con un ago smussato calibro 22.

L'ago smussato viene inserito in 20 centimetri di tubo PE 50 con un accoppiatore per tubi in acciaio inossidabile calibro 23 all'altra estremità. Assicurati di rimuovere tutte le bolle d'aria dalla linea Clamp la linea arteriosa esternalizzata dal ratto con gli emostatici. Appena sotto la spina.

Rimuovere il tappo del catetere in acciaio utilizzando un altro paio di emostatici. Inserire l'accoppiatore del tubo collegato alla siringa nella linea arteriosa e rilasciare gli emostatici che occludono il catetere arterioso esternalizzato. Quindi, aspirare il sangue arterioso del catetere nella siringa.

Se il catetere non aspira facilmente, potrebbe essere necessario spingere molto delicatamente una piccola quantità di soluzione attraverso il catetere per rimuovere la punta. Il catetere è considerato cancellato. Quando il sangue raggiunge la siringa, bloccare il tubo P 50 vicino alla siringa da un millilitro e gettare la siringa.

Sostituire con una nuova siringa riempita con soluzione salina di ghiaccio fresco di eparina. Unclamp il tubo e, tenendo la nuova siringa in posizione verticale, far scorrere la nuova siringa per rimuovere le bolle d'aria verso l'alto e lontano dalla linea. Iniettare soluzione salina eparinizzata fino a quando la linea del catetere non è chiara e priva di sangue.

Clamp la linea arteriosa appena sotto l'accoppiatore del tubo. Rimuovere il connettore della siringa dalla linea del catetere arterioso e sostituirlo con il tappo del tubo in acciaio inossidabile. Rilasciare gli emostatici occludenti, il catetere arterioso esternalizzato.

Ripetere questa procedura per la linea venosa. A causa della bassa pressione venosa, il campionamento potrebbe non essere possibile. In generale, se la soluzione salina eparinizzata può essere infusa con una resistenza minima, è probabile che il catetere sia ben posizionato nella vena.

Prima di iniziare la procedura, gli animali devono essere pesati con le soluzioni preparate e l'apparecchio di bloccaggio assemblato Dopo che l'animale è stato pesato e la pervietà del catetere confermata, metterlo in un piccolo contenitore con lettiera che limiti ma non limiti i movimenti. I ratti utilizzati in questo studio sono a digiuno per almeno cinque ore e hanno soddisfatto i requisiti di aumento di peso postoperatorio. Il peso del ratto determina la quantità di insulina necessaria qui.

Quattro milliunità per chilogrammo al minuto vengono somministrate a una velocità di due microlitri al minuto. Prepara una soluzione di destrosio al 50% e assicurati che ci sia abbastanza di entrambe le soluzioni per durare circa due ore, qui vengono utilizzate siringhe da tre millilitri. Ora sei pronto per assemblare l'apparato di serraggio.

Impostare le linee e le pompe di infusione come mostrato qui. Posizionare le siringhe di glucosio e insulina sulla pompa a siringa. Bloccare le linee e lasciare che il ratto si rilassi per 30 minuti prima di iniziare l'esperimento.

Per iniziare la procedura, prelevare un campione di insulina ed ematocrito di base Il campionamento dell'ematocrito garantisce il mantenimento del volume del sangue per tutta la durata dell'esperimento. In generale, i livelli di ematocrito non dovrebbero scendere di oltre il 10% del valore iniziale. Ottenere un campione di glucosio di base e determinare il livello di glucosio da bloccare.

Qui ci fermiamo a U glicemia o cinque millimolari. Dopo ogni prelievo di sangue, lavare la linea arteriosa con un piccolo volume di 10 unità per millilitro di soluzione salina eparinizzata per prevenire la coagulazione. Dopo aver determinato il livello di glucosio da bloccare, iniziare l'infusione della soluzione di insulina.

Registrare la glicemia a intervalli da cinque a 10 minuti e regolare la velocità di infusione del glucosio secondo necessità fino a raggiungere uno stato stazionario. Si tratta generalmente di un processo per tentativi ed errori e può richiedere da 30 minuti a più di due ore. Il livello di glucosio necessario per mantenere la glicemia dipende dal protocollo sperimentale.

Specie e condizioni presenti per essere considerate bloccate, tre letture consecutive devono rientrare in un intervallo definito. Tre letture entro circa un millimolare l'una dall'altra implicano che i livelli di glucosio hanno raggiunto un record di stato stazionario. La velocità di infusione del glucosio necessaria per mantenere la glicemia per un periodo di 30 minuti, è possibile ottenere almeno ulteriori campioni di sangue durante questo periodo.

Una volta completata la procedura di clamp, è necessario raccogliere un secondo campione plasmatico di ematocrito insulinico. Gli animali possono essere utilizzati per ulteriori test o soppressi in tessuti raccolti per ulteriori analisi. A seconda dell'animale, le linee del catetere possono rimanere pervie da cinque a sette giorni se eseguite correttamente.

La procedura di serraggio può misurare la sensibilità all'insulina allo stato stazionario. È essenziale registrare i livelli di insulina e glucosio, nonché le velocità di infusione del glucosio e i valori di ematocrito. Lo stato stazionario viene raggiunto quando i livelli di glucosio rimangono entro un millimolare l'uno dall'altro per un periodo di tempo di 30 minuti.

La velocità di infusione del glucosio rivela il livello di glucosio esogeno necessario per mantenere la glicemia U, dove il tasso possibile dovrebbe essere innestato nel tempo, rispetto a un singolo punto temporale medio. Devono essere riportati sia i livelli di insulina a digiuno che quelli di clamping. Queste misure confermano che l'insulina è stata somministrata con successo e rileveranno eventuali differenze nella risposta insulinica tra i gruppi di trattamento misurando i livelli di ematocrito al basale e, ancora una volta dopo la procedura, assicura che i livelli non siano scesi di oltre il 5% rispetto al basale nel corso dell'esperimento Seguendo questa procedura.

Altri metodi, come la somministrazione di traccianti isotopici, possono essere utilizzati per valutare l'utilizzo del glucosio specifico per tutto il corpo e per i tessuti.