Загрузка дрозофилы нервными окончаниями с кальцием Индикаторы

Здравствуйте, меня зовут Грег Маклеод. Моя лаборатория изучает регуляцию кальция в нервных окончаниях и ее влияние на передачу нервов. Мы делаем это в Oph Melanogaster.

Плодовая мушка является привлекательной моделью для нейробиологов из-за своей генетической податливости и простой доступной нервной системы. В этой нервной системе генетически доступны флуоресцентные индикаторы ENC covid для обнаружения кальциевых изменений в нервных окончаниях. Однако эти индикаторы имеют ограниченную чувствительность к кальцию и часто демонстрируют нелинейную реакцию.

Синтетические индикаторы лучше подходят для измерения быстрых изменений кальция, связанных с нервной активностью. Мы продемонстрируем технику загрузки конъюгированных с декстрином синтетических кальциевых индикаторов в живые нервные окончания в опальную лаву. Конъюгация декстрина помогает предотвратить секвестрацию показателей кальция в органеллах, таких как митохондрии.

Техника загрузки может быть применена в равной степени как к личинкам, зародышам, так и к взрослым особям. Мы будем рассекать лаву в Маленькой сигарной ванне на предметном стекле. Синий зубной воск будет поддерживать нагрузку на кровать со стороны стекла.

Возьмите блуждающую третью в звездной лаве со стороны непереполненного флакона. Поместите личинку в несколько капель охлажденного раствора Шнайдера и проколите ее через голову и хвост так, чтобы спинная средняя линия была максимально удлинена. Используйте острые микроножницы, чтобы зазубрить.

Небольшой надрез между тра здесь, достаточно большой, чтобы позволить нижнему лезвию ножниц проникнуть. Разрежьте кутикулу по дорсальной средней линии между траей до головы. Поверните личинку на 180 градусов и продлите надрез до самого хвоста.

Важно не допускать слишком глубокого проникновения нижней лопасти во внутренние органы, но личинка так как это повредит мышцы и нервы, которые хотят исследовать. Большая часть внутренностей будет проталкиваться вверх через разрез, срезать след здесь близко к хвосту одним следом здесь и разрезать нижележащую трашу до самой головы. Повторите с другой стороны.

Удалите большую часть внутренностей, срезав их и вынув из ванны. Уделите немного времени, чтобы отложить ножницы и взять вторую пару щипцов. Возьмитесь за обрезанный край кутикулы и приколите его к одной стороне.

Повторите для другой стороны. Проведите четыре сегмента по направлению к голове, чтобы повторить процедуру. Подстригать. Любые оставшиеся внутренности на этой стадии, убедитесь, что мышцы 7, 6, 13 или 12 не были повреждены ни в одном из сегментов.

Если какой-либо из них был поврежден, рассеките другую лаву, так как это повреждение неизбежно приводит к геническим сокращениям, которые сделают любую последующую визуализацию проблематичной. Полушария мозга, вентральный ганглий и сегментарные нервы теперь проявляются на следующих этапах. Мы втянем срезанный под давлением конец сегмента нерва в стеклянную ложе FOP и с помощью пластиковой заполняющей нити нанесем индикатор кальция на открытый конец нерва.

Но сначала мы покажем, как сделать филамент наполнения и эффект наполнения для создания филамента наполнения. Двухступенчатая техника вытягивания будет применена к желтому дефекту, медленно нагревается на полпути по его длине до тех пор, пока пластик не станет мягким и прозрачным. На этом этапе прекратите нагрев и сразу же потяните кончик вверх, чтобы вытянуть его в тонкую прядь.

То есть около полумиллиметра в диаметре. Обрежьте нить до длины 50 миллиметров. Теперь поместите нить под микроскоп для препарирования и закрепите срез.

Завершите ногтем большого пальца и потяните за другой конец, чтобы вытянуть тонкую нить длиной в один сантиметр. Его необходимо разрезать новым лезвием бритвы на папиросной бумаге, чтобы избежать острого крема, чтобы начинка была приготовлена. Начните с тонкостенного капилляра без какой-либо нити.

Нарисуйте его до тонкого конического конца на пуллере для домашних животных. Поднесите подготовленный материал к препарирующему эндоскопу и надрежьте коническую часть листом наждачной бумаги. Отодвиньте наконечник дистальнее надрезного отверстия от надрезной стороны так, чтобы кончик защелкнулся прямо.

Внутренний диаметр излома должен быть больше наружного. В конце заполняющей нити используйте микрокузнечную обработку для термоусадки разбитого стекла по эффекту до тех пор, пока он не достигнет внутреннего диаметра около 12 микрон. Используйте Bumps and burner, чтобы отполировать тупой конец эффекта.

Отрицательное давление может быть приложено к тупому концу эффекта с помощью плотно прилегающей кельтской трубки, соединенной с жесткой полилинейной трубкой и шприцем. Одна и та же трубка и шприц будут использоваться для забора и выведения индикатора кальция из нити. Показатель кальция должен быть растворен в дистиллированной воде до концентрации пяти милли.

Разделите этот раствор на аликвоты по пять микролитров. Нагрейте их до четырех градусов рыбы. Не замораживайте эти кваты, чтобы они оставались неразмороженными до тех пор, пока они не понадобятся.

Теперь втяните в нить от одного до двух сантиметров показателя кальция, и вы готовы приступить к самому ответственному этапу этой техники загрузки. Возьмите ножницы и щипцы и разрежьте нервы самого переднего сегмента по отдельности и близко к вентральным ганглиям. Наибольшая нервная масса сегмента AOR от вентрального отверстия.

Отрежьте от мусора весь мусор. Поместите пломбировочную нить на зубной восковой пандус кончиком в центре личинки. Прикрепите учебную трубку и шприц.

Составьте какое-нибудь решение Шнайдера в идеальный совет. Теперь подтяните конец нерва в совершенство его. Посадка должна быть снежной, но не тугой.

Он должен блокировать дальнейший вход Шнейдеров в защиту. Как правило, извлеките учебную трубку и шприц и прикрепите их к нити F. Прикоснитесь стороной нити к шнейдерам в ванне, чтобы разрядить статическое электричество, и немедленно вставьте эффект нити в пределах 50 микрон в месте разрезания нерва, фактически не касаясь.

Это.Медленно выбрасывая вверх кальций индикатора, увеличивая объем Шнайдера действует примерно на одну треть. Это будет конечная концентрация показателя кальция чуть менее двух милли, как препарат в темном, влажном месте, так и комнатной температуры около 40 минут. Здесь я хотел бы сделать два важных замечания.

Во-первых, в кончике должен присутствовать физиологический раствор для разбавления показателя кальция. Так как кальциевый показатель растворялся только в воде. Физиологический раствор должен содержать кальций в концентрации в несколько миллимоляров, так как потолок аксонов является кальцийзависимым процессом, а потолок аксонов необходим для сохранения здоровья нервных окончаний.

Второй момент заключается в том, что между перерезанием нервов и нанесением красителя на разрезанный конец нерва должно пройти не более пяти минут. Через пять минут потолочные концы аксонов исключат показатели конъюгированного декстрином кальция с молекулярной массой 10 000. Преодоление этого лимита времени потребует некоторой практики.

Не пытайтесь замедлить потолок аксонов путем снижения уровня кальция, так как это только поставит под угрозу будущую физиологическую функцию повреждения нерва. После 40-минутной инкубации препарат в Шнейдере теперь прикасается боковой стороной наполнителя нити к ванне и снова вставляется в раствор индикатора кальция с наконечника и закваски. Опять же, с помощью нити натягиваем свежие шнейдеры из ванны и полностью заполняем кровать шнейдерами.

В постельном белье не должно быть пузырьков, так как раствор Шнайдера послужит одним из проводников, изолирует от ванны, пока пэт стеклянно стимулирует нерв, снова помещают препарат в темное место не менее чем на 60 минут, но не дольше четырех часов и проводят РИН в свежие Шнейдеры каждые 30 минут во время инкубации, кальциевый показатель транспортируется вниз. Аксон концентрируется в нервном окончании за 20 минут до того, как вы захотите исследовать препарат. Промойте его раствором HL six.

Содержит желаемый уровень кальция, когда уровень кальция выше примерно 0,4 миллимоляра при глутамате или L глутаминовой кислоты до шести HL на семи миллимолярах, чтобы остановить нервное сокращение мышц. Раствор Шнайдера не подходит для визуализации кальция, поскольку он уже содержит высокие уровни как глутамата, так и кальция. Эти уровни вы захотите настроить.

Тейт также присутствует, благодаря чему автофлуоресцентная нагрузка Шнайдера, а также визуализация могут быть выполнены в HL 6 при условии присутствия кальция не менее 2 миллионов во время нагрузки. При настройке препарата на составной микроскоп для визуализации, опять же, обязательно разрядите все статическое электричество самостоятельно. Затем прикоснитесь щипцами к раствору в ванне и объективу.

Если цель является погружной, опустите ее в ванну, затем мгновенно стимулируйте основание земли, или поместите одну в ванну и вставите другую вниз по заполнению кровати квадратные импульсы постоянного тока менее трех вольт и продолжительностью 300 микросекунд надежно вызовут потенциал действия в нерве. Здесь мы видим два набора нервных окончаний в расщелине между шестой и седьмой мышцами, которые стали видимыми благодаря управлению цитозольной экспрессией GFP. Они также были предварительно заполнены индикатором кальция Rod Dextrin, который имеет другие спектры возбуждения и излучения, чем GFP.

В этом поле зрения все еще находятся нервные окончания, но Род Рин имеет низкое сродство к кальцию и почти незаметен, пока нерв находится в состоянии покоя. Тем не менее, он очень чувствителен к кальцию, который поступает в терминали во время потенциалов одиночного действия или коротких двухсекундных последовательностей стимулов. Как показано здесь при флуоресцентном анализе близко расположенных к нему штаммов частотой 80 Гц, только что показанные реакции в S-терминалах первого типа обычно выше, чем в клеммах B первого типа.

Низкоаффинные показатели кальция как у палочки декстрина, так и у гриппа. Четыре декстрина показали почти линейную реакцию на частоты нервной стимуляции в этих окончаниях в диапазоне от 10 до 80 герц. Показанный здесь пример исходит из нервного окончания на мышце номер четыре, нагруженной стержневым декстрином.