Studieren Zellrollen Trajectories auf Asymmetric Rezeptor Patterns

Dieses Protokoll beobachtet und analysiert Zellrollbahnen auf asymmetrischen Rezeptormustern, um die Entwicklung von Rezeptormustersubstraten für die markierungsfreie Zelltrennung und -analyse zu erleichtern. Beginnen Sie mit dem Mikrokontaktdruck von PEG-Molekülen auf einem Goldsubstrat, um alternierende Muster aus selbstorganisierten Monoschichten zu erzeugen, gefolgt von der Hinterfüllung des Substrats mit P-Select und Rezeptoren. Als nächstes integrieren Sie das Substrat in die Durchflusskammer. Fließen Sie die HL 60 Zellen in die Kammer.

Nehmen Sie eine Bildsequenz der rollenden Interaktion von HL 60-Zellen mit P-Selektionsmustern auf und analysieren Sie die aus dem Video konvertierten Bilder. Die Trajektorien der Rollzellenkante, die die Länge der Walzgeschwindigkeiten auf Ebene, Region und Kante verfolgen, können mit einem MATLAB-Programm ermittelt werden. Diese Methode kann Aufschluss darüber geben, wie sich HO 60-Zellen als symmetrische Rezeptormuster im Share Flow bewegen.

Dies kann zur Quantifizierung der Oberflächeninteraktionen anderer Zellen und zur direkten Analyse der Zellen durch Beobachtung ihrer Trajektorien auf Rezeptormustern verwendet werden. Und für die Entwicklung von Mikrofundamenten für die Zelltrennung. Der Mikrokontaktdruck wird verwendet, um abwechselnde Muster aus selbstorganisierten Monoschichten von Peg-Molekülen auf dem Goldsubstrat zu erzeugen.

Färben Sie zuerst den PDMS-Stempel mit fünf Millimolar PEG-Lösung in Ethanol ein. Trocknen Sie die Oberfläche 20 Minuten lang. Legen Sie den Stempel vorsichtig 40 Sekunden lang auf die Goldoberfläche und stellen Sie sicher, dass ein guter Kontakt zwischen der Goldoberfläche und dem Stempel besteht.

Es ist kein Überdruck erforderlich. Spülen Sie die Oberfläche mit Ethanol ab und trocknen Sie sie unter einem Stickstoffstrahl. Inkubieren Sie nun die Substrate in einer Perfusionskammer drei Stunden lang bei Raumtemperatur, um die verbleibenden Bereiche mit P-Selektin zu strukturieren, spülen Sie die Kammer und vfüllen Sie die Oberflächen dann eine Stunde lang mit einem Milligramm pro Milliliter, BSA, um unspezifische Wechselwirkungen zu blockieren.

Spülen Sie die Oberfläche mit DPBS-Puffer, bevor Sie das Zellwalzexperiment durchführen. Bauen Sie die Durchflusskammer zusammen und lassen Sie dann eine Suspension von 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter fließen. HL 60 Zellen über dem Muster, Oberflächen in einer rechteckigen Strömungskammer mit Neigungswinkeln des Rezeptormusters von 10 Grad.

Bei einer Raumtemperatur von 24,5 Grad Celsius. Stellen Sie die Spritzenpumpe so ein, dass sie eine Durchflussrate von 75 Mikrolitern pro Minute mit einer entsprechenden laminaren Scherspannung von 0,5 dines pro Quadratzentimeter erzeugt. Jetzt mit einem inversen Mikroskop und einer montierten Kamera zeichnet HL 60 beim Rollen auf.

Wechselwirkungen mit Klebstoff p, select und Substraten. Verwendung eines vierfachen Objektivs mit einer Rate von einem Bild pro Sekunde für eine Dauer von 300 Sekunden. Führen Sie drei unabhängige Experimente durch.

Präsentieren Sie die Daten als Mittelwert und Standardabweichung der Durchschnittswerte, die aus jedem Experiment erhalten wurden. Mikroskopbilder, die aus dem Video von HL 60.Rolling konvertiert wurden. Wechselwirkungen mit adhäsiven p, select und Substraten zeigen helle und dunkle Regionen, die den p-Selektinrezeptor- bzw. PEG-Regionen entsprechen.

Die Spuren werden hier mit einem angepassten MATLAB-Programm abgegrenzt. Der Kantenneigungswinkel betrug 10 Grad und die Schubspannung 0,5 Winkel pro Quadratzentimeter. Weitere Analysen bilden die Verteilung der Kriechungsbahnlänge, den Mittelwert der Kriechlauflänge sowie VE und VP, die Rollgeschwindigkeiten an der Kante und an der Innenseite der Bänder.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Zellbahnen auf den asymmetrischen Rezeptormustern untersuchen können.