3Dイメージングと形態素解析のための成体マウスの脳血管キャスティング

この手順の全体的な目標は、成体マウスの脳血管系を3Dで視覚化することです。これは、最初に胸腔を開き、PBSの口腔内灌流を通じて血管系からすべての血液を取り除くことによって達成されます 灌流後のヘパリンでは、キャスティング剤を左心室に注入して循環系全体を灌流します。次に、灌流された脳を取り外し、パラホルムアルデヒドに固定します。

手順の最後のステップは、エタノールとサリチル酸メチルで脳組織を脱水して清澄化することです。最終的には、透明なマウス脳を示す結果が得られ、その血管樹を明視野顕微鏡または解剖顕微鏡で画像化し、マイクロCTスキャンによって画像化することができます。こんにちは、カリフォルニア大学サンフランシスコ校のスペン・ウォーカーと申します。

今日は、成体マウスの脳の血管模型を作ります。血管造影などの既存の方法に対するこの技術の主な利点は、マウスなどの小動物に適用できることです。放射性物質は必要なく、比較的簡単な手順で実行できます。

これは、材料の放射線不透過性特性による明視野、顕微鏡分析、CTスキャン、組織学的および免疫組織化学的分析など、さまざまな分析ツールに適応をもたらしました。では、始めましょう。生理食塩水で希釈したケタミンとキシラジンの腹腔内注射によりマウスに麻酔をかけ、足をつまんで完全麻酔を確認しました。

麻酔が確認されたら、はさみを使用して、剣状突起のすぐ下の胸部を切開します。次に、横隔膜を切断し、次に胸郭の背側と腹側の間の上を切断します。胸腔を露出させるには、胸骨と隣接する胸壁を折り畳み、止血剤を使用してそれらを固定して心膜嚢を露出させます。

次に、必要に応じてピンセットで心膜嚢を開き、心臓を露出させます 100ミリメートルの水銀に設定された灌流ポンプを使用して、PBSとヘパリンの1ミリリットルあたり5ユニットを摂氏37度に温めて灌流を開始します。ポンプの流出に接続されている鈍い22ゲージの針を心臓の頂点近くの左心室に挿入します。すぐにカット。

右心房を開いて全身の血液流出を可能にし、血液が循環から除去されるまで洗い流し続けます。.まず、5ミリリットルの希釈剤と4ミリリットルのろ過された化合物を混合して、鋳造剤溶液を作成します。次に、硬化剤の450マイクロリットルを追加し、20分以内に鋳造剤溶液を使用してください。

使用前に直接キャスティング剤溶液を混合してください。適切な粘度を確保するために、鋳造剤溶液を10ミリリットルのシリンジに引き込みます。鈍い20ゲージの針をシリンジに取り付け、針に溶液を入れます。

血液を洗い流すために使用されるのと同じ穴から左心室に針を挿入し、針を所定の位置に固定します 止血クランプを使用して、過剰な圧力が注入中に誤った流れや血管の破裂につながる可能性があるため、キャスティング剤溶液を左心室に手動で約3ミリリットル/分ゆっくりと注入します。腸や肝臓の血管系における鋳物剤の可視化、遠位肢の変色、鼻や舌の変色など、灌流が成功した兆候を探します。適切な灌流を達成するために、必要に応じて針を再調整します。

脳を取り出し、4%パラホルムアルデヒドに摂氏4度で一晩置く。次に、初日から室温で25%エタノールで脳を直接濃縮したエタノールに直接入れることにより、7日間にわたって脳を脱水します。脳が脱水されたら、灌流した脳をサリチル酸メチルに2日間室温で2日間浸すことにより、血管の周りの脳組織を明確にし、明文化された脳全体の血管系を明視野顕微鏡下でサリチル酸メチルに浸漬することにより、また解剖顕微鏡またはマイクロCTスキャンを用いて、 血管系は、脳を切片化することなく、さまざまな焦点面で観察できるだけでなく、個々の微小血管を高倍率で見ることができます。

下のパネルに示されています。解剖スコープでは、脳血管構造全体を1つの焦点面で見ることができ、その3次元構造をよりよく視覚化できます。この画像は、大血管の形態と全脳の血管系を示していますが、明視野顕微鏡で撮影した写真に示されている詳細が欠けています。

マイクロCTスキャンは、血管系の3D視覚化を可能にし、回転可能な3Dモデルの構築を可能にします。ここに示す血管系を視覚化するのは、マイクロCTによって検出された異常な脳血管構造であり、同じ血管奇形の明視野顕微鏡画像と相関しています。これらのデータを総合すると、血管キャスティング後に同じサンプルを複数のイメージングツールを使用して分析できることがわかります。

このビデオを見れば、マイクロフィル溶液を使用して成体マウスの捻挫の血管をキャストする方法を十分に理解できるはずです。この手順には、マイクの血管系脳室内注射からの血液の除去、成体マウス脳の溶液収集と処理、明視野顕微鏡を使用した脳血管系のイメージングが含まれます。この手順の全体的な目標は、成体マウスの脳の脳血管系を3次元で見ることです。