In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Genexpression in embryonalen Vorläuferzellen des Hinterhirns durch die Einführung von Plasmid-DNA durch Elektroporation zu einem früheren Zeitpunkt der Schwangerschaft zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem die Embryonen zunächst am 11,5. Schwangerschaftstag isoliert und mit der Rückenseite nach oben in steriler, phosphatgepufferter Kochsalzlösung ausgerichtet werden. Der zweite Schritt besteht darin, etwa 50 Mikroliter des Expressionsplasmids in 0,01%schnelles Grün zu injizieren.

Bei einer erfolgreichen Injektion wird das gesamte ventrikuläre System mit der DNA Fast Green Mischung gefüllt. Als nächstes wird der Embryo einem elektrischen Impuls ausgesetzt. Die Seite des Embryos, die der positiv geladenen Elektrode am nächsten liegt, nimmt die Plasmid-DNA auf.

Die andere Seite dient als interne Negativkontrolle. Der letzte Schritt ist das Einsetzen der Embryonen in eine Gewebekultur für mindestens 24 Stunden. Letztendlich wird das elektrobewertete Gen nach 24-stündiger Kultur exprimiert und kann immunhistochemisch beurteilt werden.

Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass die Manipulation von embryonalen Hinterhirnvorläufern zu früheren Zeitpunkten der Schwangerschaft möglich ist. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen auf diesem Gebiet zu beantworten, z. B. wie verschiedene uralische Gene das Schicksal embryonaler Vorläuferzellen beeinflussen können. Beginnen Sie diesen Vorgang mit der Sterilisation der Präparierwerkzeuge und der Lamina-Flow-Haube gemäß dem beigefügten Manuskript.

Zur Entnahme der Embryonen wird eine euthanasierte weibliche Maus, die am Gestationstag E 11,5 mit Pops schwanger ist, auf die Präparierschale in der Haube gelegt. Besprühen Sie anschließend den Bauch der Maus mit 70%Ethanol. Öffnen Sie die Bauchhöhle und stecken Sie die Wände an die Präparierschiene.

Ziehen Sie dann die Gebärmutterhörner heraus, so dass sie in der Bauchhöhle aufliegen. Öffnen Sie mit einer Pinzette vorsichtig die Wand des Gebärmutterhorns. Verwenden Sie einen 20-Millimeter-Löffel, um die Embryonen im Dottersack vorsichtig aus der Plazenta zu entfernen.

Danach legen Sie die Embryonen in eine 100 Millimeter große Gewebekulturschale. Vorgefüllt mit 10 Millilitern sterilem, einmal PBS vorgewärmtem Sterilem. In diesem Schritt wird der erste Embryo in eine neue 100-Millimeter-Schale umgefüllt, die mit 10 Millilitern sterilem einmaligem PBS befüllt und auf 37 Grad Celsius vorgeheizt wurde.

Als nächstes nimmst du den Dottersack vorsichtig heraus und entsorgst ihn. Positionieren Sie dann den Embryo so, dass seine Rückenseite nach oben zeigt. Halten Sie den Embryo vorsichtig mit den sieben Millimeter langen Elektrodenpaddeln unter ein Präpariermikroskop.

Platzieren Sie die Elektroden einzeln auf jeder Seite des Neuralrohrs auf Höhe des vierten Ventrikels des Hinterhirns. Danach verwenden Sie eine 1-cm³-Spritze, um die Mischung aus Plasmid-DNA und 0,01 % Schnelltest zu ziehen. Im Allgemeinen sollten 500 Mikroliter der Mischung für die Elektroporation von mindestens acht bis 10 Embryonen ausreichen. Als nächstes stechen Sie vorsichtig die Dachplatte über dem vierten Ventrikel mit einer 25-Gauge-Fünf-Achtel-Tuberkulinnadel ein, die an der einen CC-Spritze befestigt ist.

Injizieren Sie dann etwa 50 Mikroliter des DNA-DI-Gemisches in den Ventrikel. Erfolgreiche Injektionen zeichnen sich dadurch aus, dass das DNA-DI-Gemisch das gesamte ventrikuläre System ausfüllt. Ein alternatives Mittel zur Abgabe des DNA-DI-Gemisches besteht darin, auf das ventrikuläre System zuzugreifen, indem das Pergament über dem Mittelhirn punktiert wird, der Pulsgenerator eingeschaltet wird, dann fünf Quadratimpulse mit Hilfe eines Elektrodenimpulsgenerators abgegeben werden und die Sieben-Millimeter-Elektrode das Gewebe paddelt, das der positiv geladenen Elektrode am nächsten kommt.

Während Sie dann das Plasmid in einer Lamina-Flow-Haube aufnehmen, füllen Sie die Ulkusvertiefungen einer 12-Well-Kulturschale mit zwei Millilitern DME MF 12-Medium, das mit 10 % fötalem Rinderserum, 5 % Pferdeserum, 1 % Glutamin und 1 % Penicillin-Streptomycin ergänzt wurde, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wurde. Kneifen Sie dann den Embryo mit einer Pinzette in der Mitte ein. Entfernen Sie anschließend den hinteren Teil des Embryos und legen Sie den vorderen Teil in eine der gefüllten Vertiefungen der Kulturschale.

Wiederholen Sie den Vorgang für alle Embryonen und füllen Sie nur die äußeren Vertiefungen der 12-Well-Platte. Um eine Kontamination der Kulturkultur der Kulturen zu vermeiden, werden die Embryonen in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5% Kohlendioxid für 24 Stunden exprimiert, um das elektroporierte Plasmid zu exprimieren. Wenn eine längere Kulturzeit gewünscht wird, füllen Sie die Sermulden einer neuen 12-Wal-Schale mit zwei Millilitern des D-M-E-M-F 12-Mediums.

Übertragen Sie die Embryonen mit einem sterilisierten Löffel in die Vertiefungen einer neuen Platte. Legen Sie sie dann zurück in den 37 Grad Celsius heißen Inkubator und kultivieren Sie sie bis zu 48 Stunden lang, um die Embryonen für die Analyse zu fixieren. Füllen Sie eine 12-Well-Platte mit dem Einmal-PBS-Blatt, übertragen Sie dann die Embryonen und spülen Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius.

Als nächstes fixieren Sie die Embryonen in 2%Paraldehyd in einmal PBS für zwei Stunden bei vier Grad Celsius. Spülen Sie sie dann dreimal in einem Mal PBS bei vier Grad Celsius für fünf Minuten aus. Auch hier wird nach dem Befüllen eine neue 12-Well-Platte mit 30%iger Saccharose in einmal PBS gefüllt.

Übertragen Sie die Embryonen in diese Vertiefungen und äquilibrieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Anschließend betten Sie die Embryonen mit einem Trockeneis-Ethanol-Bad in die optimale Schnitttemperaturmasse ein oder lagern sie bei minus 20 Grad Celsius. Im Endschnitt werden die Embryonen in 30 Mikrometer große Schnitte mit einem Kryostaten gesetzt.

Montieren Sie sie auf Objektträger und lagern Sie sie bei minus 20 Grad Celsius von uni Histochemical. Die später gezeigte Studie sind die repräsentativen Ergebnisse der Immunhistochemie für GFP an den Querschnitten eines elektroporierten E 11.5 Embryos nach 24 Stunden Kultur. Die hier gezeigten Pfeile zeigen die Dachplatte, in der der Sekundärantikörper gefangen ist.

Die Ergebnisse zeigen, dass der elektroporierte Bereich der unteren ROIC-Lippe verengt war und sich nicht über die gesamte vordere hintere Achse des Neuralrohrs erstreckte. Hier sehen Sie die Ergebnisse von zwei der analysierten Proteine: MASH one und math one. Wir beobachteten, dass die Mehrheit der Embryonen nach der Elektroporation und Kultivierung ein normales Expressionsniveau beibehält, verglichen mit den Kontrollembryonen bei einem 11,5 Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie nun ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den In-vitro-Elektroporationsassay verwenden können, um die Genexpression in den Vorläuferzellen der embryonalen Membran der Maus zu manipulieren.