In-vivo-Elektroporation von Entwicklung Maus Retina
24. Juni 2011
Eine Methode für die Einbeziehung von Plasmid-DNA in murinen Zellen der Netzhaut zum Zwecke der Durchführung entweder gewinnen oder Verlust der Funktion Studien In vivo Vorgestellt. Diese Methode nutzt die vorübergehende Erhöhung der Durchlässigkeit der Zelle Plasmamembranen durch die Anwendung eines äußeren elektrischen Feldes induziert.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein in vivo Elektroporationsexperiment an neonatalen Mäusen durchzuführen, um genetisches Material stabil in die Zellen der Netzhaut einzubringen. Dies wird durch eine erste Anästhesie erreicht, bei der eine neugeborene Maus etwa fünf bis 10 Minuten lang auf Eis knallt. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die Verbindung der verschmolzenen Augenlider zu identifizieren und das Auge zu öffnen, indem entlang dieser Verbindung geschnitten wird.
Anschließend wird ein Schnitt im Auge gemacht, um das Einführen der Mikroinjektionsspritze zu erleichtern. Die Mikroinjektionsspritze wird dann durch den Schnitt eingeführt und die DNA-Lösung in den subretinalen Raum injiziert. Schließlich wird eine Pinzettenelektrode auf den Kopf des Pops gesetzt und eine Reihe von elektrischen Impulsen abgegeben.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der retroviralen Transduktion besteht darin, dass bei der In-vivo-Elektroporation keine biologischen Wirkstoffe als Werkzeuge für die Genübertragung erzeugt und gehandhabt werden müssen. Infolgedessen erfordert die Technik weniger Arbeit, weniger Reagenzien und kann an jedem Arbeitsplatz durchgeführt werden, der für Tierversuche zugelassen ist. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in der Technik sind, Schwierigkeiten haben, da es Zeit und Wiederholung braucht, um ein Gefühl für die Platzierung der Mikroinjektionsspritze in den subretinalen Raum zu entwickeln.
Jimmy DeMilo, ein Postdoktorand in meinem Labor, wird das Verfahren vorführen. Da die für die Elektroporation erforderliche DNA-Konzentration relativ hoch ist, wird die gewünschte Plasmid-DNA zunächst mit einem Maxi-Prep amplifiziert, inkompetente Zellen extrahiert, dann gereinigt und auf etwa fünf Mikrogramm pro Mikroliter konzentriert. Schneller grüner FCF-Farbstoff wird als Injektionstracer zugesetzt.
Nachdem die Plasmid-DNA präpariert wurde, werden neugeborene Mausbabys etwa fünf Minuten lang auf Eis betäubt und überwacht, bis die Bewusstlosigkeit durch Kompression der Fußballen bestätigt wird. Tauschen Sie den Bereich des Auges aus, der mit 70%igem ISOP-Profilalkohol injiziert werden soll, und verwenden Sie ein Präpariermikroskop, um das FUS-Junktionalepithel zu identifizieren, wo die Augenlider zusammenkommen. Öffnen Sie das Auge vorsichtig mit einer scharfen 30-Gauge-Nadel, indem Sie entlang des verschmolzenen Verbindungsepithels schneiden, ohne übermäßigen Druck nach unten auszuüben oder über den Bereich des Augenlids hinaus zu schneiden.
Sobald das Augenlid geöffnet und das Auge freigelegt ist, machen Sie mit der Nadelspitze einen kleinen Schnitt in der Sklera in der Nähe des Übergangs zur Hornhaut, wobei Sie darauf achten, nicht zu tief einzudringen und die Linse zu durchstechen. Führen Sie die stumpfe Injektionsnadel in den Schnitt ein. Nur so lange, bis der Widerstand der gegenüberliegenden Skleralwand spürbar ist, injizieren Sie langsam 0,3 Mikroliter der viskosen DNA-Lösung in den subretinalen Raum.
Achten Sie darauf, nicht zu fest gegen die Skleralwand zu drücken, drehen Sie das Tier, um eine gleichmäßige Verteilung der DNA-Lösung in der Netzhaut zu überprüfen. Tränken Sie zunächst die Pinzettenelektrode in PBS, um die elektrische Leitfähigkeit zu maximieren. Platzieren Sie dann den Kopf des injizierten Welpen zwischen den Elektroden, wobei das injizierte Auge neben der Pluspolelektrode und das nicht injizierte Auge neben der Minuspolelektrode liegt.
Wenden Sie fünf quadratische Impulse mit einem Impulsgenerator an, wobei jeder Impuls 80 Volt und 50 Millisekunden lang ist, mit einem Intervall von 950 Millisekunden zwischen den Impulsen. Zum Schluss erwärmen Sie die Welpen unter einer Wärmelampe, bis sie sich von der Eisnarkose erholt haben. Geben Sie die elektroporierten Welpen nach der Genesung am dritten Tag nach der Geburt an ihre Mutter zurück.
Die Mehrzahl der elektroporierten EGFP-Zellen sitzt in der neuroplastischen Schicht der Netzhaut und weist keine ausgeprägten morphologischen Merkmale der differenzierten neuralen Gliazellen der Netzhaut auf. Am 14. postnatalen Tag finden sich elektroporierte Zellen in der äußeren Kernschicht und der inneren Kernschicht der Netzhaut sowie in den verschiedenen markierten Zellen. Zeigen nun charakteristische morphologische Merkmale differenzierter Neuronen.
Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Schritte reibungslos und gleichmäßig auszuführen. Es ist sehr einfach, die Netzhaut während der Mikroinjektion zu beschädigen, und es sind Übungen erforderlich, um die manuelle Geschicklichkeit zu entwickeln, die erforderlich ist, um Gewebeschäden zu vermeiden. Befolgen Sie dieses Verfahren.
Andere Methoden, wie z. B. Immunhistochemie oder In-situ-Hybridisierung, können durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob die Expression von Genen von Interesse in der Elektronetzhaut nach oben oder unten reguliert wird.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine Methode zur Einbringung von Plasmid-DNA in murine retinale Zellen durch in vivo Elektroporation vor. Die Technik nutzt ein externes elektrisches Feld, um die Permeabilität der Zellmembran zu erhöhen und so die Einführung von genetischem Material zu erleichtern.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Genetik
- Elektrophysiologie
Hintergrund
- Elektroporation ist eine Technik zur Einführung von DNA in Zellen.
- Neonatale Mäuse werden oft für In-vivo-Studien aufgrund ihres Entwicklungsstadiums verwendet.
- Retinale Zellen sind entscheidend für das Verständnis von Sehvermögen und damit verbundenen Störungen.
- Diese Methode zielt darauf ab, die genetische Manipulation in der retinalen Forschung zu verbessern.
Zweck der Studie
- Um Gewinn- oder Verlust-der-Funktion-Studien in retinalen Zellen durchzuführen.
- Um genetisches Material stabil in retinale Zellen von neonatalen Mäusen einzuführen.
- Um die Auswirkungen genetischer Modifikationen auf die retinale Funktion zu untersuchen.
Verwendete Methoden
- Neonatale Mäuse werden anästhesiert und für die Operation vorbereitet.
- Ein Einschnitt wird am Übergang der verwachsenen Augenlider gemacht, um Zugang zum Auge zu erhalten.
- Eine Mikroinjektionsspritze wird verwendet, um eine DNA-Lösung in den subretinalen Raum zu injizieren.
- Eine Elektrode liefert eine Serie von elektrischen Impulsen, um die DNA-Aufnahme zu erleichtern.
Hauptergebnisse
- Die Methode führt erfolgreich Plasmid-DNA in retinale Zellen ein.
- Elektroporation erhöht die Permeabilität der Zellmembranen.
- Genetische Modifikationen können auf funktionelle Ergebnisse hin untersucht werden.
- Diese Technik bietet ein wertvolles Werkzeug für die retinale Forschung.
Schlussfolgerungen
- Die Elektroporationsmethode ist effektiv für genetische Manipulation in vivo.
- Dieser Ansatz kann das Verständnis der retinalen Biologie vorantreiben.
- Zukünftige Studien können verschiedene genetische Modifikationen mit dieser Technik untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Rapid in vivo electroporation of the developing mouse retina enables efficient functional interrogation of gene candidates during neurodevelopment, bypassing the time and resource constraints of traditional knockout models. This approach supports high-throughput gain- and loss-of-function studies, directly informing target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The method's flexibility in manipulating gene expression accelerates portfolio triage and prioritization for ophthalmic and neurodevelopmental programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Facilitates rapid functional assessment of gene candidates in a native tissue context.
- Enables both gain- and loss-of-function studies to clarify gene roles in cell fate and differentiation.
- Supports mechanistic de-risking by allowing combinatorial gene perturbation and cis-regulatory analysis.
- Provides internal histological controls via non-electroporated retinal regions for robust comparative analysis.
Screening & Assay Development
- Generates validated in vivo models for downstream phenotypic screening of genetic constructs.
- Allows for quantitative assessment of gene expression using bicistronic reporters such as GFP.
- Supports reproducible and scalable workflows for evaluating multiple constructs or regulatory elements.
- Enables preparation of retina-specific assays for compound or genetic screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems for modeling retinal development and dysfunction.
- Enables continuity from discovery-stage gene function studies to preclinical validation of therapeutic hypotheses.
- Supports identification of translational biomarkers through targeted gene manipulation and expression analysis.
- Reduces risk of off-target systemic effects by restricting manipulation to the retina.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates at the early discovery and target validation stages, bridging to lead identification and preclinical research for ophthalmic and neurodevelopmental indications.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven testing of gene function and regulatory elements in vivo.
- Screening: Provides a platform for reproducible, quantitative readouts of gene expression and phenotypic outcomes.
- Analytics: Supports statistical comparison of electroporated versus control regions for robust data interpretation.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models and biomarker discovery when supported by construct design.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable workflow for diverse gene function and regulatory studies in retinal tissue.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target validation for retinal and neurodevelopmental programs.
- Operational Value: Reduces labor, biosafety requirements, and time-to-data compared to viral or knockout approaches.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and portfolio prioritization by enabling rapid, multiplexed gene interrogation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and de-risking of early-stage targets with in vivo functional data.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in neonatal microinjection and electroporation to minimize tissue damage.
- Needs access to pulse generators, tweezer electrodes, and high-quality DNA preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for construct design, injection protocols, and data analysis.
- Adaptation to other tissues or developmental stages may require protocol optimization.
- Manual dexterity and practice are critical to achieving reproducible results and minimizing variability.
