In utero und ex vivo Elektroporation für die Genexpression in Maus retinalen Ganglienzellen

In utero beginnt die retinale Elektroporation mit einem Bauchschnitt an einem anästhesierten Muttertier der Stadien E 13,5 bis 14,5, um die Embryonalkette freizulegen. Die DNA wird in eine Netzhaut pro Embryo injiziert und die Köpfe werden elektroporiert, wodurch die DNA von RGC-Vorläuferzellen aufgenommen wird. Bei E 18,5 sind die Embryonen perfundiert und GFP-positiv.

Netzhaut- und visuelle Projektionen werden auf X-vivo-Netzhautelektroporation analysiert. E 13,5 bis 14,5 Köpfe werden mit der Rückenseite nach oben in eine Schale gesteckt und die DNA wird in den peripheren dorsalen Bereich beider Netzhaut injiziert, gefolgt von der Elektroporation. Die gesamte Netzhaut wird 40 Stunden lang kultiviert, gefolgt von der Beschichtung von GFP-positiven Netzhautexplantaten für In-vitro-Kulturassays.

Hallo, ich bin Tim Petros aus dem Labor von Dr. Carol Mason in der Abteilung für Pathologie und Zellbiologie und Neurowissenschaften an der Columbia University. Heute zeigen wir Ihnen, wie Sie Gene in die embryonale Spiegelnetzhaut einführen können, indem Sie in utero und ex vivo Netzhautelektroporation verwenden. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zu untersuchen, wie die Manipulation der Genexpression und der retinalen Ganglienzellen ihren Projektionsweg spezifisch am Chiasma opticum verändert.

Okay, fangen wir an. Bevor Sie eine Netzhautelektroporation in utero versuchen, ist die richtige Vorbereitung unerlässlich. In unserem schriftlichen Protokoll finden Sie detaillierte Informationen zur Vorbereitung der anästhetischen Sterilisation von Instrumenten und Instrumenten, zur Vorbereitung der DNA-Lösungen für die Injektion und der antibiotischen antimykotischen Lösungen für die Zeit nach der Operation, zur Vorbereitung des Operationsbereichs und zur Erwärmung der geeigneten Lösungen.

Mikropipetten mit feiner Spitze sollten vor der Operation mit einem Mikroelektrodenabzieher vorbereitet werden. Brechen Sie die Spitze, um eine abgewinkelte Spitze für die In-utero-Elektroporation zu bilden. Injizieren Sie zuerst 0,15 Milliliter der Anästhesiemischung interperitoneal in einen Damm der Stufe E 13,5 bis E 14,5. Es sollte drei bis sieben Minuten dauern, bis der Damm vollständig unter Narkose steht, um zu testen, ob die Maus narkotisiert ist.

Kneifen Sie die Hinterpfote zusammen und prüfen Sie, ob das Tier in der Pause, in der das Tier der Betäubung erliegt, nicht reagiert. Schneiden Sie ein kleines Stück davon ab und pipettieren Sie fünf Mikroliter der DNA-Lösung auf den Param. Biegen Sie einen Metalldrahtkolben in einem 90-Grad-Winkel und führen Sie ihn mit dem Kolben in eine gezogene Mikropipette ein. Aspirieren Sie die DNA-Lösung in die Mikropipette.

Legen Sie nun die Mausembryonen chirurgisch frei. Bitte beachten Sie das JoVE-Protokoll von Wal Inus et al. für die richtige Technik. Jetzt sind wir bereit für die Elektroporation.

Der erste Schritt besteht darin, die Netzhaut richtig auszurichten. Dann injizieren wir DNA in die Netzhaut und dann werden wir den Kopf mit Elektroparaden versehen. Okay, fangen wir an.

Okay, der erste Schritt besteht darin, die Netzhaut so auszurichten, dass sie wie hier nach oben zeigt. Dann durchstechen wir mit der Mikropipette die Fruchtwand und injizieren die DNA im Idealfall direkt in die Netzhaut. Sobald Sie die Gebärmutterwand durchbohrt haben, drücken Sie den Kolben nieder, wodurch die DNA in die Netzhaut ausgestoßen und der Kolben zurückgezogen wird.

Sobald Sie also die DNA injiziert haben, sollten Sie sehen, dass der grüne Farbstoff das Fruchtwasser und auch die Netzhaut füllt. Okay, jetzt, da wir die Injektion durchgeführt haben, sind wir bereit für die Elektroporation. Um also zu beten, werden wir die Elektroporationspaddel um den Embryo herum platzieren, wobei das positive Paddel neben der Netzhaut liegt, die mit Elektroparade versorgt wurde.

Und wenn es soweit ist, ein depressiver Fußpaddel, der den Embryo mit Strom versorgt. Sie sehen, wie sich Blasen auf dem Pan-Paddel mit negativer Ladung bilden, und das zeigt, dass die Elektroporation ein Erfolg war. Und Sie wiederholen diesen Schritt für alle injizierten Embryonen.

Das ist also die Art und Weise, wie man DNA in eine embryonale Netzhaut elektroparadiert. Sie können diesen Vorgang bis zu so vielen Embryonen wiederholen, wie Sie möchten. Denken Sie daran, dass je mehr Embryonen Sie zur Schau stellen, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass die Mutter die Embryonen abtreibt.

Nachdem Sie die Embryonen mit Elektroparaden versehen haben, massieren Sie mit den Fingern die Embryonalkette wieder in den Muttermund ein, sobald die Embryonen wieder eingesetzt sind. Gießen Sie etwa zwei Milliliter der antibiotischen Antimykotikum in die Bauchhöhle. Verwenden Sie das Blutstillen und die Pinzette, um das Peritoneum zu nähen, beginnend mit einem Doppelknoten am vorderen Teil des Schnitts und fahren Sie in einem einfachen, kontinuierlichen Nahtmuster bis zum hinteren Teil des Schnitts fort.

Verwenden Sie die letzte Schlaufe, um die Naht abzubinden und überschüssiges Nahtmaterial zu kürzen. Zum Schluss heften Sie den Schnitt zu. Heben Sie dazu die Haut am vorderen Teil des Schnitts mit einer stumpfen Pinzette an.

Achten Sie darauf, die Haut vom Bauchfell zu trennen. Platzieren Sie als Nächstes die Zähne des Klammergeräts um die Haut und um den Klammerer zu drücken, heften Sie den Schnitt weiter bis zum hinteren Ende, was normalerweise fünf bis sieben Klammern erfordert. Wenn Sie mit dem Heften fertig sind, wischen Sie die Wunde um die Klammern herum mit einem Alkoholpad ab.

Lassen Sie das Muttertier auf dem Heizkissen erholen und setzen Sie es dann in einen neuen Käfig. Wenn sie anfängt zu zucken und sich umzudrehen, dauert es in der Regel zwischen 15 und 90 Minuten, bis sie aufwacht, um Schmerzen und Beschwerden zu minimieren. Mütter erhalten Buprenorphin nach dem Aufwachen und zu einem späteren Zeitpunkt.

Wenn die Beschwerden weiterhin eine Dehydrierung verhindern, injizieren Sie dem Muttertier etwa zwei bis vier Stunden nach der Operation subkutan einen Milliliter Kochsalzlösung. Nach 24 Stunden nach der Operation sollte das Muttertier wieder zu normalem Verhalten zurückkehren und regelmäßig trinken und fressen. Wir werden die elektroporierte Netzhaut bei E 18,5 für die Analyse ernten.

Alternativ können Sie das Muttertier im postnatalen Alter gebären und die Netzhaut ernten lassen, um sie in späteren Jahren zu analysieren. Nachdem Sie das Tier betäubt haben, schneiden Sie mit einer Schere die Haut und das Bauchfell unter den Klammern auf. Um die Bauchhöhle und die Gebärmutterhörner freizulegen, entnehmen Sie einen elektroporierten Embryo und stecken Sie den Embryo durch die Gliedmaßen in eine Präparierschale, schneiden Sie mit der Bauchseite nach oben, schneiden Sie durch die Bauchhaut und das Bauchfell und schneiden Sie durch die seitlichen Teile des Brustkorbs, um das Herz freizulegen.

Als nächstes stechen Sie mit der Perfusionsnadel in die linke Herzkammer und schneiden den rechten Vorhof mit der Mikroschere auf. Starten Sie nun die Perfusion und lassen Sie PFA etwa 60 bis 90 Sekunden lang fließen. Wenn es richtig gemacht wird, sollte das Blut aus dem rechten Vorhof austreten und der Embryo sollte blass werden.

Sobald die Perfusion abgeschlossen ist, enthaupten Sie den Embryo und sammeln Sie die Köpfe in 4 % PF in einem konischen 15-Milliliter-Fläschchen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle elektroporierten Embryonen und alle Muttertiere. Wenn Sie mit der Entnahme aller Embryonen fertig sind, opfern Sie das Muttertier durch Zervixluxation.

Halten Sie den Kopf über Nacht bei vier Grad Celsius in 4 % PFA und waschen Sie ihn dann mehrere Tage lang in PBS. Nach dem Waschen mit PBS sind Sie jetzt bereit, die Netzhaut auf eine erfolgreiche GFP-Expression zu untersuchen. Stecke zuerst den Kopf mit der Netzhaut nach oben in eine Sezierschale und tauche ihn in PBS ein. Entfernen Sie die Haut um die Netzhaut, um das retinale Pigmentepithel oder RPE mit einer 26-einhalb-Gauge-Nadel freizulegen.

Punktion der ventralen Netzhaut am RPE-Übergang der Linse. Führen Sie als nächstes eine Kante der Mikroschere in dieses Loch ein und machen Sie einen vertikalen Schnitt durch die ventrale Netzhaut zur Sehscheibe. Auf diese Weise können Sie die Netzhaut ausrichten, wenn Sie sie herausnehmen.

Trennen Sie das RPE von der Netzhaut, indem Sie das RPE mit einer Pinzette am ventralen Schnitt greifen. Und verwenden Sie eine weitere Pinzette, um das RPE von der Netzhaut abzulösen, insbesondere an der RPE-Linsenverbindung, an der das RPE fest befestigt ist. Nachdem Sie das RPE entfernt haben, fassen Sie die Linse mit einer Pinzette und ziehen Sie sie nach oben und weg.

Um die Linse zu entfernen, entfernen Sie vorsichtig die Netzhaut, indem Sie eine Pinzette unter die Netzhaut legen und den Sehnervenkopf einklemmen, um die Netzhaut zu befreien. Übertragen Sie schließlich die Netzhaut auf A PBS gefüllt. Achten Sie darauf, dass Sie im Auge behalten, von welcher Netzhaut die Netzhaut stammt, welche Köpfe diese Schritte für die kontralaterale Netzhaut wiederholen und für alle anderen elektroporierten Embryonen, verwenden Sie ein Fluoreszenz-Präpariermikroskop, um die gesamte Netzhaut auf GFP-positive Netzhaut zu scannen, was darauf hindeutet, dass die Elektroporation bei diesem Embryo erfolgreich war und diese Netzhaut und das entsprechende Gehirn für die weitere Analyse verarbeitet werden können.

Das ex vivo Verfahren der retinalen Elektroporation erfordert mehrere zusätzliche Vorbereitungsschritte, die sich von der in utero Elektroporation unterscheiden. Detaillierte Informationen zur Aufbereitung und Sauerstoffanreicherung des serumfreien Mediums sowie zur Vorbereitung von Kulturschalen und Border-Assays finden Sie im schriftlichen Protokoll. Nach der Betäubung des Tieres wird die Bauchhöhle wie zuvor gezeigt geöffnet, die gesamte Embryonalkette entfernt und in D-M-E-M-F 12 auf Eis gelegt.

Das Muttertier sollte dann mit einer Zervixluxation eingeschläfert werden. Schneiden Sie mit einer Schere durch die Gebärmutterwand, entnehmen Sie dann die Embryonen aus der Fruchtblase und sammeln Sie sie in D-M-E-M-F 12 und halten Sie sie auf Eis, köpfen Sie Embryonen und halten Sie sie in DMEA-Medium auf Eis, die Körper können entsorgt werden. Verwenden Sie als Nächstes eine Mundpipette oder eine Kolbenpipette und füllen Sie eine Mikropipette mit der gewünschten Menge DNA-Lösung.

Dann überweisen Sie einen. Gehen Sie zu einer Präparierschale mit PBS und stecken Sie den Kopf mit der Rückenseite nach oben. Begeben Sie sich zum Präparierbereich für die Injektionen.

Okay, jetzt sind wir bereit für den Elektro-Prate. Ich werde die DNA in den peripheren Rücken beider Netzhaut injizieren und dann den Kopf galvanisieren. Okay, los geht's.

Der erste Schritt besteht darin, die Haut oberhalb der Netzhaut zu entfernen. Um das zu tun, verwenden wir die Pinzette, um die Haut abzuschälen. Jetzt können wir den dorsalen Teil beider Netzhaut sehen.

Als nächstes werde ich DNA direkt unter der retinalen Pigmentepithelschicht in beide Netzhäute injizieren. Dazu halte ich die Elektrode in einer fast waagerechten Position und durchdringe das RPE am periphersten dorsalen Teil der Netzhaut. Du solltest sehen, dass der grüne Farbstoff den Netzhautraum ausfüllt und in die PBS-Lösung austritt.

Okay, jetzt ist es Zeit für die Elektroporation. Zuerst lösen Sie den Kopf. Jetzt werden wir die Paddel mit Elektro beuten und wir wollen, dass sich das positive Paddel auf der ventralen Seite des Kopfes befindet.

Wir platzieren also den Kopf in den Paddeln mit dem positiven Paddel auf der Bauchfläche und üben Druck aus, um das Paddel so stabil zu halten. Und jetzt machen wir eine Elektro-Parade. Du kannst sehen, wie sich die Blasen auf dem Paddel und auf der Oberseite des Kopfes bilden.

Und das ist es. Jetzt bewegen wir den Kopf auf eine Schale mit Median. Das war's also mit der ex vivo retinalen Elektroporation.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für so viele Embryonen und DNA-Bedingungen, wie Sie möchten. Jetzt bereiten wir uns darauf vor, die Netzhaut zu kultivieren. Nachdem Sie alle Elektrovorbereitungen abgeschlossen haben, geben Sie etwa 1,5 Milliliter sauerstoffhaltige SFM-Lösung in eine Vier-Well-Schüssel und bewahren Sie sie auf Eis auf.

Lassen Sie eine Vertiefung für jede unterschiedliche DNA-Lösung injizieren. Übertragen Sie als nächstes einen elektroporierten. Gehen Sie mit D-M-E-M-F 12 zu einer Präparierschale, wobei eine Netzhaut nach oben auf der ventralen Netzhaut oder der der Zielregion gegenüberliegenden Seite zeigt.

Drücke und reiße mit einer feinen Pinzette ein Loch in das RPE. Verwenden Sie dieses Loch als Ausgangspunkt, um RPE aus der Netzhaut zu entfernen. Schneiden oder beschädigen Sie das Auge nicht, da dies dazu führt, dass die Netzhaut während der Inkubation auf sich selbst zusammenfällt.

Nachdem Sie das RPE entfernt haben, verwenden Sie eine Pinzette, um die Netzhaut herauszustechen, indem Sie den Sehnerv an der Basis der Netzhaut einklemmen und die Linse intakt lassen. Übertragen Sie die Netzhaut auf das sauerstoffhaltige SFM in der Vier-Well-Schüssel. Drehen Sie den Kopf über und wiederholen Sie die Netzhautentfernung für das kontralaterale Auge.

Führen Sie diesen Schritt für alle elektroporierten Köpfe durch und inkubieren Sie die Netzhaut im sauerstoffhaltigen SFM bei 37 Grad Celsius für 40 bis 48 Stunden. Nach der Inkubation der gesamten Netzhaut wird die Netzhaut aus einer Vertiefung mit sauerstoffreichem SFM in einen Petrischalendeckel mit D-M-E-M-F 12 übertragen. Wählen Sie mit einem Fluoreszenz-Präparierfernrohr eine Netzhaut aus und visualisieren Sie den GFP-positiv exprimierenden Teil der Netzhaut.

Als nächstes präparieren Sie mit einem Mikroskalpell und einer Pinzette den nicht GFP-positiven Teil der Netzhaut, so dass nur ein GFP-positiver Teil der Netzhaut übrig bleibt. Es ist hilfreich, während der gesamten Dissektion ständig zwischen fluoreszierendem und normalem Licht zu wechseln. Um die GFP-positive Netzhaut spezifisch auszuwählen, übertragen Sie das GFP-positive Stück der Netzhaut in eine Vertiefung mit G-M-E-M-F 12.

Wiederholen Sie diesen Schritt für die gesamte Netzhaut von einem Nun, verwenden Sie für jede DNA-Erkrankung eine neue Petrischale und D-M-E-M-F 12 Medium, um diese GFP-positiven Netzhautstücke in kleinere Netzhautexplan für die Beschichtung zu zerlegen. Schneiden Sie mit einem Präparierfernrohr das große Stück der GFP-positiven Netzhaut mit einem Mikroskalpell in einen kleineren Grundriss. Der Explan sollte etwa 200 bis 300 Mikrometer Länge und Breite betragen.

Ein GFP-positiver Netzhautblock sollte etwa vier bis 10 GFP-positive retinale Explan produzieren. Sammeln Sie alle Explan in einer Vertiefung mit D-M-E-M-F 12. Wiederholen Sie diesen Schritt für alle GFP-positiven Netzhautregionen, die entnommen werden. Nach der Zubereitung aller GFP-positiven Netzhautexpläne 250 Mikroliter kaltes SFM plus 0,4 % Methylcellulose in laminierte beschichtete Kulturschalen geben.

Übertragen Sie als Nächstes vier bis acht positive GFP-Explan in die Kulturschale und ordnen Sie den X-Explan mit der Pinzette vorsichtig zu einem Polygon an, wobei sich der X-Explan auf halbem Weg zwischen der Mitte und dem Rand der Schale befindet. Bestimmen Sie, auf welcher Seite des X-Plans es sich um die RGC-Schicht handelt. Dies kann durch die Suche nach RPE-Kristallen erfolgen, die manchmal an der äußeren Netzhautschicht haften bleiben können, was darauf hindeutet, dass es sich bei der gegenüberliegenden Seite um die RGC-Schicht handelt.

Die RGC-Seite enthält in der Regel auch einige zelluläre Trümmer, die bei der richtigen Erklärung mit der RGC-Schicht nach unten helfen können. Drücke mit einer Pinzette die Mitte des Explans fest zusammen, so dass er an dem Glasdeckel am Boden der Kulturschale haftet. Nach dem Anrichten werden alle X-Explane auf einer Kulturschale in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator gegeben.

Retinal X-Explantate zeigen nach 24 Stunden ein reichliches Axonwachstum und können für zahlreiche In-vitro-Assays verwendet werden, die dann 30 Minuten lang mit 4 % PFA fixiert werden. Und Immunfärbung für den Border-Assay. Übertragen Sie den positiven 4G-FP-Plan in eine Schale, die für den Border-Assay vorbereitet wurde.

Ordnen Sie die X-Explantate in einer geraden Linie an, die dem fluoreszierenden Rand mit dem gewünschten Substrat entspricht. Verwenden Sie unter einem Fluoreszenzpräpariermikroskop eine Pinzette, um den EXPLAN so zu plattieren, dass sie etwa 50 bis 150 Mikrometer vom Fluoreszenzrand entfernt sind. Wechseln Sie zwischen den beiden fluoreszierenden Kanälen, um den grünen Explan und den roten Rand zu visualisieren.

Als nächstes inkubieren Sie die Schalen 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius, so dass die RGC-Axone genügend Zeit haben, das Grenzsubstrat zu erreichen. X explan kann dann 30 Minuten lang in 4%PFA fixiert werden, gefolgt von einer Immunfärbung. Nach der retinalen Elektroporation in utero.

Retinale Lochhalterungen können präpariert werden, um GFP-positive R-GCs in der Netzhaut und halb intakt sichtbar zu machen. Visuelle Systeme können darauf vorbereitet werden, GFP-positive Axone im gesamten Sehnerv, Chiasma opticus und Sehtrakt sichtbar zu machen. Alternativ können frontale Kryoschnitte über die Netzhaut und den RGC-Signalweg durchgeführt werden, um GFP-positive RGC-Zellkörper in der Netzhaut und Axone im Chiasma und Trakt des Sehnervs sichtbar zu machen und zu analysieren.

Alle retinalen Axone werden mit Neurofilamentfärbung sichtbar gemacht. Darüber hinaus kann die Elektroporation in utero verwendet werden, um das RGC-Axon-Targeting im lateralen Genkern LGN zu untersuchen, indem Jungtiere bei P vier bis P 10 entnommen werden. Bei P sind acht GFP-positive Axone im LGN sichtbar, wobei CTB LOR 5 94 roter Kanal in die ipsilaterale Netzhaut injiziert wurde und CT bor 6 47 blauer Kanal in die kontralaterale Netzhaut, um die gesamte RGC-Projektion nach ex vivo Elektroporation und Plattierung von Netzhautimplantaten zu markieren.

Eine Untergruppe der RGC-Axone ist RGFP-positiv und kann sowohl bei niedrigerer als auch bei höherer Leistung deutlich sichtbar gemacht werden, wie im oberen bzw. unteren Bild zu sehen ist. Die Reaktion von GFP-positiven Axonen kann durch Plattieren von XS neben den Rändern verschiedener Substrate analysiert werden, die hier in blau dargestellt sind. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie Gene in die embryonale Spiegelnetzhaut einführen können, indem Sie in utero und ex vivo Netzhautelektroporation verwenden.

Obwohl wir uns bei unserer Analyse auf die Axonführung des Chiasmas opticus konzentriert haben, könnte diese Technik für diejenigen von Vorteil sein, die die RGC-Differenzierung, die dendritische Morphologie und die elektrophysiologischen Eigenschaften von retinalen Ganglienzellen untersuchen. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Schädigung der Netzhaut bei der Injektion der DNA zu minimieren und die Embryonen während des gesamten Experiments immer mit PBS zu hydratisieren. Das war's also.

Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.