Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren besteht darin, zu demonstrieren, wie Zellen oder DNA präzise in frühe postimplantationsstadien von Maus-Embryonen übertragen werden können. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise die Untersuchung des in-vivo-Potenzials von in vitro kultivierten Zellen oder die Funktion bestimmter Gene in spezifischen embryonalen Entwicklungsstadien. Die wesentlichen Vorteile dieser Techniken liegen darin, dass keine spezielle Ausrüstung erforderlich ist und experimentelle Eingriffe an frühen postimplantationsfähigen Maus-Embryonen ermöglicht werden. Nachdem ein trächtiges Weibchen am Tag E 7,5 oder E 8,5 gemäß dem Versuchsprotokoll getötet wurde, verwenden Sie eine Schere und Pinzetten, um die Gebärmutter zu isolieren, und legen Sie diese in eine 30-Millimeter-Schale, die mit M2-Medium gefüllt ist, wobei Sie zwei Paar feiner Pinzetten verwenden.

Zerlegen Sie das Myometrium vorsichtig und lösen Sie dann die Decidua ab, wobei darauf geachtet werden muss, die extraembryonalen Hohlräume nicht zu verletzen. Entfernen Sie die Rikersche Membran, indem Sie sie mit einer Pinzette anfassen und langsam vom Embryo abtrennen. Prüfen Sie anschließend unter einem stereoskopischen Auflichtmikroskop die Embryonen daraufhin, ob Dottersack, Amnion und der okzipitale Placentakonus intakt sind. Überführen Sie die Embryonen mit einer Pipette in eine saubere Schale mit M2 und legen Sie sie auf den Deckel einer 30 mm großen Plastik-Petri-Schale, der auf Eis oder einer Eisplatte steht, um die Embryonen teilweise abzukühlen.

Bereiten Sie das Kulturmedium vor und kultivieren Sie die Embryonen gemäß dem Textprotokoll, um kultivierte Zellen in Mausembryonen zu transplantieren. Beginnen Sie damit, mithilfe einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze die Eblast-Stammzellen, die ubiquitär GFP exprimieren, von einer 6-Loch-Kulturplatte abzukratzen. Überführen Sie die Zellen in die Schale mit den Embryonen.

Befestigen Sie eine manuell gezogene Pfropfkapillare an dem Aspiratorschlauch, um mit einer Mundpipette vorsichtig eine oder mehrere Zellansammlungen mit mehr als 20 Zellen in die Pfropfkapillare aufzusaugen. Danach blasen Sie die Zellen vorsichtig aus, um große Zellklumpen zu zerstreuen. Wählen Sie einen Zellklumpen mit etwa 10 bis 20 Zellen aus und saugen Sie ihn in die Pfropfkapillare auf.

Erneut den Klumpen mit einer Pinzette nahe der Öffnung der Kapillare halten. Halten Sie das Embryo locker an Ort und Stelle und führen Sie die Transplantationskapillare in den interessierenden Bereich ein. Um eine Öffnung zu erzeugen.

Drücken Sie den Klumpen vorsichtig aus der Pfropfkapi­lare heraus, wobei ein kurzes Geflecht aus 10 bis 20 Zellen im Embryo verbleibt. Lassen Sie die Embryonen in derselben Schale mit M2-Medium und verwenden Sie ein fluoreszenzbasiertes Auflichtmikroskop mit Kamera, um die gepfropften Embryonen abzubilden. Halten Sie die Aufnahmezeit so kurz wie möglich, um eine übermäßige Belastung der Embryonen durch Licht und Wärme zu vermeiden.

Unmittelbar nach der Bildgebung unter Verwendung einer Paste überführen Sie die Embryonen mit einem minimalen Volumen an M-zwei-Medium in vorab angeglichenes Kulturmedium und kultivieren Sie diese gemäß den Anleitungen im Textprotokoll, bevor Sie Elektroporationsexperimente durchführen. Verwenden Sie eine horizontale Mikropipettierpolarisierung, um DNA-Injektionspipetten mit einer feinen Spitze und einer Öffnung von weniger als 10 Mikrometern herzustellen, um Gewebeschäden zu vermeiden. Für die Elektroporation mit Glas-Kapillaren verwenden Sie einen Mikroschmelzofen, um die Öffnung der DNA-Injektionspipetten auf einen inneren Durchmesser von entweder 20 oder 30 Mikrometern mit einer sauberen Spitze und ohne abgebrochene Kanten zu kürzen. Befestigen Sie jede Platinelektrode an einem dünnen isolierten Draht und führen Sie sie in einen Mikroinjektionsnadelhalter ein, der mit Isolierband überzogen ist.

Um eine handgefertigte Kapillarelektrode herzustellen, einen Platin-Draht mit einem Durchmesser von 0,2 Millimetern in eine Elektroporations-Glaskapillare mit einer festen Öffnung von 20 oder 30 Mikrometern Durchmesser einführen. Um den elektrischen Strom zu bündeln und die Plasmid-DNA auf einen kleinen Zielbereich im Embryo zu übertragen. Um eine L-förmige Elektrode herzustellen, einen Platin-Draht mit einem Durchmesser von 0,2 Millimetern verbiegen, sodass eine L-Form entsteht, wobei der horizontale Teil des L etwa einen Millimeter lang ist.

Befestigen Sie die Nadelhalter an Standardmikromanipulationsinstrumenten. Verbinden Sie die Kapillärelektrode mit der Anode der Stromversorgung. Verbinden Sie die L-förmige Elektrode mit der Anode des Multimeters.

Verbinden Sie dann die Kathode des Multimeters mit der Kathode der Stromversorgung. Füllen Sie die Elektroporations-Glaskapillare mit PBS bis auf ein bis zwei Millimeter unter den Rand und führen Sie die gerade Platinelektrode in die Glaskapillare ein, bis sie den Boden der Kapillare erreicht. Befestigen Sie die L-förmige Elektrode auf der Oberfläche der mit PBS gefüllten 30-Millimeter-Petri-Schale.

Verwenden Sie eine pneumatische Piko-Pumpe für die DNA-Injektion. Führen Sie die Injektionsnadel von der lateralen Eblastenregion in die Amnionhöhle des Embryos ein und injizieren Sie etwa fünf µL DNA-Lösung in die Höhle oder bis diese vollständig gefüllt ist. Achten Sie darauf, den Embryo nicht zu beschädigen.

Dann positionieren Sie das Embryo vorsichtig zwischen den Elektroden und bewegen Sie die Kapillarelektrode an die genaue Stelle, an der die DNA eingeführt werden soll. Elektroporieren Sie das Embryo mit 200 Volt in sechs Impulsen, die jeweils 50 Millisekunden dauern, wobei zwischen den Impulsen jeweils eine Sekunde Pause liegt. Überführen Sie das Embryo unmittelbar in vorab equilibriertes Kulturmedium, bevor Sie die Elektroporation für das nächste Embryo wiederholen.

Detektieren Sie zwei Stunden nach der Elektroporation elektroporierte lebende oder tote Zellen. Laut dem hier gezeigten Textprotokoll handelt es sich bei dem Embryo mit epi PSCs, die ubiquitär EGFP exprimieren, um einen auf E 7,5 transplantierten und 24 Stunden ex vivo kultivierten Embryo. Wenn 10 bis 16 fscs in Embryonen vom Typ E 7,5 transplantiert wurden, integrierten sie sich gut und proliferierten innerhalb des Wirts-Embryos.

Jedoch führt das Einbringen mehrer Zellen nicht zu einer besseren Chimärismusrate, sondern vielmehr zu nicht eingebauten Zellhaufen, wie hier gezeigt. Wie in dieser Elektroporation von GFP-exprimierenden Plasmiden dargestellt. GFP-positive Zellen wurden ein bis zwei Stunden nach der Elektroporation nachgewiesen.

Wenn distale Eblastzellen im späten Primitivstreifen-Stadium elektroporiert wurden, trugen die markierten Zellen nach 24 Stunden Kultivierung zum Neuraldarm bei, was den bekannten Fate-Maps von Eblastzellen in Gastrula-Stadium-Embryonen entspricht. Diese Abbildung zeigt, dass, ähnlich wie bei der Verwendung anderer Elektrodentypen für die Elektroporation, auch die Kapillarelektrode einen gewissen Grad an Zelltod im Zielbereich verursachte. Da dieser Bereich im Vergleich zu benachbarten Regionen dunkler erschien, wurden die Kerne abgestorbener Zellen mit einem membranimpermeablen, weitroten Fluoreszenzfarbstoff markiert.

Es wurde bestätigt, dass die kapillare Elektroporation nur eine geringe Anzahl von toten Zellen in der Nähe der Elektroporationsstelle verursacht. Bei der Durchführung dieser Verfahren ist es wichtig, die Embryonen innerhalb von zwei Stunden mit der Kultivierung zu beginnen. Nach der Isolierung des Uterus von den Mäusen am Ende der Kultur können die Embryonen fixiert werden.

Andere Methoden wie das Schneiden und Färben können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise zum Beitrag von Spender- oder elektrogeflechteten Zellen zu den Wirts-Embryonen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten wir ein gutes Verständnis dafür haben, wie Zellen oder DNA präzise in frühe postimplantative Maus-Embryonen übertragen werden können.