Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, zu zeigen, wie Zellen oder DNA präzise in frühe Mausembryonen nach der Implantation übertragen werden können. Diese Methoden können helfen, zentrale Fragen der Entwicklungsbiologie zu beantworten, wie z.B. die Prüfung des In-vivo-Potenzials von in vitro kultivierten Zellen und der Funktionen bestimmter Gene in bestimmten Embryonalstadien. Die Hauptvorteile dieser Techniken bestehen darin, dass sie keine spezielle Ausrüstung erfordern und experimentelle Manipulationen von früh posierenden Plantagenmaus-Bryo ermöglichen. Nachdem Sie ein trächtiges Weibchen am Tag E 7,5 oder E 8,5 gemäß dem Textprotokoll geopfert haben, verwenden Sie eine Schere und eine Pinzette, um die Gebärmutter zu isolieren und sie in eine 30-Millimeter-Schale zu legen, die mit M zwei Medium und zwei Paar feinen Pinzetten gefüllt ist.

Reißen Sie das Myometrium vorsichtig auseinander und schälen Sie dann die Dezidua ab, wobei Sie darauf achten müssen, die zusätzlichen Embryonalhöhlen nicht zu durchstechen. Entfernen Sie die Riker-Membran, indem Sie sie mit einer Pinzette einklemmen und langsam vom Embryo trennen. Überprüfen Sie dann unter einem Stereo-Präpariermikroskop die Embryonen, um sicherzustellen, dass das Dottersack-Amnion und der Op-Plazentakegel intakt sind. Übertragen Sie die Embryonen mit einer Pipette in eine saubere Schale von M zwei und legen Sie sie auf einen 30 Millimeter großen Plastikdeckel der Petrischale auf Eis oder eine Eisplattform, um die Embryonen teilweise zu kühlen.

Bereiten Sie das Kulturmedium vor und kultivieren Sie Embryonen gemäß dem Textprotokoll, um kultivierte Zellen in Mausembryonen zu transplantieren. Beginnen Sie mit der Verwendung einer 200-Mikroliter-Pipettenspitze, um Ebblast-Stammzellen, die ubiquitär GFP exprimieren, aus einer Sechs-Well-Kulturplatte physisch abzukratzen. Übertragen Sie die Zellen in die Schale, in der sich die Embryonen befinden.

Befestigen Sie eine von Hand gezogene Transplantationskapillare an dem Aspiratorröhrchen, um eine Mundpipette zu machen, saugen Sie vorsichtig an der Mundpipette, um einen oder mehrere Zellklumpen von mehr als 20 Zellen in die Transplantatkapillare zu ziehen. Blasen Sie dann die Zellen vorsichtig aus, um große Klumpen zu zerstreuen. Wählen Sie einen Klumpen mit etwa 10 bis 20 Zellen aus und ziehen Sie ihn in die Transplantationskapillare.

Halten Sie den Klumpen wieder mit einer Pinzette nahe der Öffnung der Kapillare. Halten Sie den Embryo locker an Ort und Stelle und führen Sie die Transplantationskapillare in den gewünschten Bereich ein. So erstellen Sie eine Öffnung.

Stoßen Sie den Klumpen vorsichtig aus der Transplantationskapillare aus, wobei der kurze Strang von 10 bis 20 Zellen im Embryo verbleibt. Lassen Sie die Embryonen in der gleichen Schale aus M zwei Medium und verwenden Sie ein Fluoreszenzpräparationsmikroskop und eine Kamera, um die transplantierten Embryonen abzubilden. Beschränken Sie die Bildgebungszeit auf ein Minimum, um zu vermeiden, dass die Embryonen übermäßigem Licht und Hitze ausgesetzt werden.

Unmittelbar nach der Bildgebung mit einer Paste übertragen Sie die Embryonen mit einem minimalen Volumen von M zwei Medien auf ein voräquilibriertes Kulturmedium und eine Kultur gemäß den Richtlinien im Textprotokoll, bevor Sie Elektroporationsexperimente durchführen, verwenden Sie eine horizontale Mikropipette polar, um DNA-Injektionspipetten mit einer feinen Spitze und einer Öffnung von weniger als 10 Mikrometern zu ziehen, um Gewebeschäden zu vermeiden. Für die Glaskapillar-Elektroporation verwenden Sie eine Mikroschmiede, um die Öffnung der DNA-Injektionspipetten auf einen Innendurchmesser von 20 oder 30 Mikrometern mit einer sauberen Spitze und ohne abgebrochene Kanten zu schneiden. Befestigen Sie jede Platinelektrode an einem dünnen isolierten Draht und stecken Sie sie in einen Mikroinjektionsnadelhalter, der mit Isolierband bedeckt ist.

Um eine handgefertigte Kapillarelektrode herzustellen, führen Sie einen Platindraht mit einem Durchmesser von 0,2 Millimetern in eine Elektroporationsglaskapillare mit einer festen Öffnung von 20 oder 30 Mikrometern Durchmesser ein. Um den elektrischen Strom zu fokussieren und die Plasma-DNA in eine kleine Region des Embryos zu bringen. Um eine L-förmige Elektrode zu erzeugen, biegen Sie einen Platindraht mit einem Durchmesser von 0,2 Millimetern, wodurch eine L-Form entsteht, bei der der horizontale Teil des L etwa einen Millimeter lang ist.

Montieren Sie die Nadelhalter auf Standard-Halter für Mikromanipulationsinstrumente. Verbinden Sie die Kapillarelektrode mit der Anode des Netzteils. Verbinden Sie die L-förmige Elektrode mit der Anode des Multimeters.

Verbinden Sie dann die Kathode des Multimeters mit der Kathode des Netzteils. Füllen Sie die Elektroporationsglaskapillare bis auf ein bis zwei Millimeter von der Oberseite mit PBS und führen Sie die gerade Platinelektrode bis zum Boden der Kapillare in die Glaskapillare ein. Verankern Sie die L-förmige Elektrode auf der Oberfläche der 30 Millimeter großen Petrischale, die mit PBS gefüllt ist.

Verwenden Sie eine pneumatische Pico-Pumpe für die DNA-Injektion. Führen Sie die Injektionsnadel aus dem lateralen Eblast in die Fruchthöhle des Embryos ein und injizieren Sie etwa fünf Mikroliter DNA-Lösung in die Höhle oder bis sie vollständig gefüllt ist. Achten Sie darauf, dass der Embryo nicht platzt.

Positionieren Sie dann den Embryo vorsichtig zwischen den Elektroden und bewegen Sie die Kapillarelektrode genau an die Stelle, an der die DNA abgegeben werden soll. Mit 200 Volt in sechs Impulsen von jeweils 50 Millisekunden Dauer wurde der Embryo mit einem Intervall von einer Sekunde zwischen den einzelnen Impulsen elektroporiert. Übertragen Sie den Embryo sofort auf ein voräquilibriertes Kulturmedium, bevor Sie die Elektroporation für den nächsten Embryo wiederholen.

Erkennen Sie elektroporierte lebende oder tote Zellen zwei Stunden nach der Elektroporation. Gemäß dem hier gezeigten Textprotokoll handelt es sich um einen Embryo mit ubiquitär exprimierenden Epi-PSCs, das EGFP exprimiert, das auf E 7,5 transplantiert und 24 Stunden lang ex vivo kultiviert wurde. Wenn 10 bis 16 fscs in E 7,5-Embryonen transplantiert wurden, integrierten und vermehrten sie sich gut im Wirtsembryo.

Die Transplantation von mehr Zellen führt jedoch nicht zu einem besseren Chimärismus, sondern zu nicht eingebauten Klumpen, wie hier gezeigt. Wie in dieser Elektroporation von GFP-exprimierenden Plasmiden gezeigt. GFP-positive Zellen wurden ein bis zwei Stunden nach der Elektroporation nachgewiesen.

Wenn distale Eblastzellen im späten primitiven Streifenstadium eines Embryos elektroporiert wurden, trugen markierte Zellen nach 24 Stunden in Kultur zur neuralen derm bei, was den bekannten Schicksalskarten von Eblastzellen in Embryonen im gastro-Stadium entspricht. Diese Abbildung zeigt, dass die Kapillarelektrode, ähnlich wie bei der Verwendung anderer Elektrodentypen für die Elektroporation, auch einen gewissen Grad an Zelltod in der Zielregion verursachte. Da diese Region im Vergleich zu benachbarten Regionen dunkler erschien, starben die Zellkerne toter Zellen mit einer membranundurchlässigen fernroten Fluoreszenz ab.

Es wurde bestätigt, dass die Kapillarelektroporationstechnik nur zu einer geringen Anzahl abgestorbener Zellen in der Nähe der Elektroporationsstelle führt. Während Sie diese Verfahren versuchen, ist es wichtig, innerhalb von zwei Stunden mit der Kultivierung der Embryonen zu beginnen. Nach der Isolierung der Gebärmutter von den Mäusen am Ende der Kultur können die Embryonen fixiert werden.

Andere Methoden wie das Schneiden und Färben können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. den Beitrag eines Spenders oder elektrogeflochtener Zellen zu den Wirtsembryonen. Nachdem wir uns dieses Video angesehen haben, sollten wir ein gutes Verständnis dafür haben, wie wir Zellen unserer DNA präzise in frühe Mausembryonen nach der Implantation übertragen können.