Name: Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch In utero Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die In-utero-Elektroporation zur genetischen Manipulation des Hypothalamus bei Maus-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Transfektion von DNA in das dritte Ventrikel zur Untersuchung hypothalamischer Entwicklung.

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Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.

1. Herstellung von DNA und Glasmikropipetten zur Injektion <ol><li> Gute Qualität Glasmikropipetten sind unerlässlich, um anfängliche hohe Rate der Fehlgeburten durch den Verlust von Fruchtwasser zu reduzieren. Das Verfahren zur Glasmikropipetten ziehen ist gut 13,18,25 dokumentiert. Mit 1,2 mm Durchmesser gezogen Kapillaren in einem herkömmlichen Sutter P-97-Gerät mit den Einstellungen P = 500; Wärme = 300; Ziehen = 40; Velocity = 50; Zeit = 50. Den Abzieher mit 3 mm &quot;Trog&quot; Filamente (Sutter Instrument FT330B). Die 2 mm Größe Filamente für uns weniger zufriedenstellende Ergebnisse lieferte. Auf der anderen Seite, hat Abschrägung des Mikropipettenspitzen nicht scheinen, um für uns zu verbessern. </li><li> Auflösen gereinigt endotoxinfreiem Plasmid-DNA in PBS (Zellkultur), die 0,1% Fast Green bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 2 pg / pl. Die Fast Green machen den injizierten Lösung sichtbar im embryonalen Hirn Ventrikel. </li><li> Legen Sie 10 ul der DNA-Lösung in die Glasmikropipette. </li&gt; <li> Schließen Sie das Glasmikropipette dem Einspritzsystem (Pico Pump) oder Mund Pipette. </li></ol> 2. Anästhesie Vorbereiten des Operationstisches mit einem Heizkissen und der chirurgischen Instrumente. Schalten Sie die kalte Lichtquellen, um die Visualisierung der Embryonen zu erleichtern. Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente mit zum Beispiel eine Glasperle Sterilisator. Drei verschiedene Anästhesieverfahren sind für dieses Protokoll möglich (siehe Diskussion). Hier beschreiben wir die, die wir für die besten halte, mit Isofluran Inhalation für Narkose (Durchfluss 0,5 l / min) sowie die Wartung (Durchfluss 1 L / min). <ol><li> Führen Sie die Maus schwanger in einem kleinen transparenten (so die Maus bleibt sichtbar) Behälter mit dem Komesaroff Mark 5 Narkosegerät durch eine kurze Rohrlänge. </li><li> Füllen Sie den Verdampfer mit Isofluran, öffnen Sie dann die Sauerstoff-Flasche an das Gerät angeschlossen. Brennen Sie eine oder zwei Impulse isoflUrane / Sauerstoff (0,5 L / min) in den Behälter mit der Maus und Uhr für Narkose um in. </li><li> Nehmen Sie die Maus aus, bedecken ihre Augen mit Salbe zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen und passen die Flow-Anästhesie-Maske auf den Kopf sofort. </li></ol> 3. Laparotomie <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch nach oben Heizkissen (sonst seine Körpertemperatur sinken wird sehr schnell abnimmt Heilungschancen) und sichern ihren Körper in Ort durch die Festsetzung seiner vier Beine an den Seiten mit Klebeband. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose, indem für den Verlust der Reaktion auf Reflexstimulation (zB Zeh oder Schwanz Prise mit festem Druck). </li><li> Rasur der Bauchdecke und desinfizieren sie mit dem iodophorpovidone-Iod (Braunoderm). </li><li> Einen Längsschnitt (1 bis 1,5 cm lang) auf der Bauchhaut. Dann schneiden Sie das Bauchfell. Zeigen Baumwolle Gaze um den Einschnitt. Machen Sie einen Uterushorns sichtbar und ziehen Sie es vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette auf die PBS gespült gauze. Spülen Sie die Gebärmutter mit PBS sehr oft, damit es immer angefeuchtet (2A und 2B). Während des gesamten Verfahrens zu vermeiden Ziehen des Mesometrium oder die Gebärmutter eng, da hohe Druck in der Gebärmutter für den Embryo Erhöhung der Chancen der Verlust von Flüssigkeit beim Einspritzen was Abtreibung übertragen wird. </li></ol> 4. DNA-Injektion in das Gehirn Ventrikel <ol><li> Halten des Uterus in einer Weise, dass die Hirnkammern visualisiert werden kann. Nicht umfassend neu ein Embryo, der sich in einer ungünstigen Position liegt - das erhöht nur die Chancen der Abtreibung. </li><li> Ein Blick auf die Embryo Kopf von oben, die Lücke visuell lokalisieren oder Riss zwischen den linken und rechten kortikalen Hemisphären. Die Halbkugeln sind leicht zu unterscheiden und die lateralen Ventrikel in ihnen (nicht ins Visier genommen werden) können in der Regel als etwas dunkler Formen wahrgenommen werden. Wenn ein Embryo sich als optimaler Ausrichtung zur DNA-Injektion (Figures 2C und 2D), ist es möglich, die Gebärmutterwand durchstoßen und in die dritte Kammer auf einmal. Halten der Glas-Mikropipette auf 45 ° an der Gebärmutterwand und durchstechen am rostralen Ende des Spalts zwischen kortikalen Halbkugeln, dringt etwa 1 mm. Auf diese Weise wird die Spitze des Glas-Mikropipette wird in die dritte Ventrikel des Gehirns (nicht die lateralen Ventrikel) (2C und 2D). In Embryonen ungünstiger orientiert ist es sinnvoll, zunächst durchbohren der Gebärmutterwand (immer bei 45 °) in der Nähe des embryonalen Kopf, legen Sie die Mikropipettenspitze in die richtige Position zwischen den kortikalen Hemisphären und erst dann zu perforieren das Gehirn. Spritzen etwa 1 ul DNA-Lösung in den dritten Ventrikel (eine gute Injektion füllt die Ventrikel mit grünen Flüssigkeit). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Embryonen von einem Uterus Horn. Dies ermöglicht einige Zeit für die DNA-Lösung gleichmäßig zu mischen mit dem ventrikulären Flüssigkeit und erreichen die Zellstofe Neuroepithel. </li></ol> 5. Targeting der Hypothalamus für die Elektroporation <ol><li> Schalten Sie das Elektroporator auf und passen Sie die Einstellungen entsprechend der embryonalen Alter (für E12.5 verwenden wir 5 Rechteck-Pulse, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Verwendung Pluspol der Edelstahl Nadelelektrode (CUY550-10) und als negativer Pol einer runden flachen Elektrode (CUY700P4L). (Es ist wichtig, dass die Elektroden kleiner als die Embryos sind, da sonst der Strom nur fließt, um den Embryo, aber nicht durch sie.) </li><li> Wählen Sie für die Elektroporation jene Embryonen, deren dorsalen Seite nach oben (dh wandte sich dem Experimentator) (wie die meisten von ihnen sind), und entsorgen Sie diejenigen, deren Ausrichtung ist nicht günstig. Jetzt ist es sicher, um die Gebärmutter mit Ethanol desinfiziert Finger oder mit Handschuhen berühren. Halten des Uterus mit einer Pinzette, würde jedoch der Stromfluss bei der Elektroporation stören. </li><li> Pierce die Gebärmutterwand durch das Embryonenschutzgesetz den Kopf zwischen dem amniotic sac und der Plazenta in Abstützung nach unten durch sie mit der Spitze der Nadelelektrode. Verwenden Sie den Zeigefinger der anderen Hand als Widerlager. Über 5 mm von der Elektrodenspitze muss nun zwischen der Fruchtblase und der Gebärmutterwand, etwa auf dem Niveau des Mittelhirns (2E und 2F). Denken Sie daran, dass dies das &quot;Targeting Elektrode&quot; ist, so wird seine Position zu bestimmen, welcher Teil des Hypothalamus Neuroepithel höchstwahrscheinlich transfiziert bekommen ist. Der Embryo muss sehr vorsichtig &quot;gequetscht&quot; zwischen den Elektroden. </li><li> Mit der anderen Hand, positionieren Sie den runden flachen Elektrode außerhalb der Gebärmutter Wand auf der gegenüberliegenden Seite des Embryos Kopf (2E und 2G). </li><li> Verwenden Sie den Fußschalter, um Spannung anzulegen (50 V, 50 ms ON, 950 ms AUS, 5 Rechteckpulse). </li><li> Langsam ziehen die Nadel-Elektrode aus der Gebärmutter, während die Gebärmutter wieder mit dem Zeigefinger der anderen Hand - wenn amniotic Flüssigkeit durch den durchlöcherten Wand verloren geht, in der Regel der Embryo unterziehen Abtreibung. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Embryonen. </li><li> Bringen Sie den Uterushorns in den Bauch und wiederholen Sie die Injektion und Elektroporation in den Überrest Horn. </li></ol> 6. Finishing der Chirurgie <ol><li> Nach der Injektion und Elektroporation von allen Embryonen, legen die Gebärmutter wieder in den Bauch sehr sorgfältig, exakt positioniert, wie sie vor und feucht die Bauchhöhle mit Kochsalzlösung vor dem Schließen waren. </li><li> Naht das Bauchfell mit Catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Für die Schließung der Haut Verwendung &quot;unterbrochen Stich&quot; methodwith ein beständiger Naht (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L). </li><li> Desinfizieren Sie die Bauch Oberfläche mit PVP-Jod (Braunoderm) und injizieren eine nicht-steroidalen entzündungshemmenden subkutan (z. B. 100 ul einer Lösung von 1.10 Rimadyl in 0,9% NaCl) oder, noch besser, ein Opioid wie buprenorphine (Temgesic, 0,05 bis 0,1 mg / kg Körpergewicht in 0,9% NaCl), um Schmerzen zu lindern. </li><li> Entfernen Sie die Mutter aus der Narkose Maschine und legen Sie sie in einem Käfig, die von einem Heizkissen erwärmt wird. Überwachen Sie die Maus ständig, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Später, überprüfen Sie die Tiere täglich um sicherzustellen, dass sie von dem Verfahren ohne Anzeichen einer Infektion oder Schmerzen erholt. </li></ol> 7. Analyse der Ergebnisse <ol><li> Ernten der Embryos (oder postnatals) entsprechend der gewünschten Tag der Analyse. Postnatale Mäuse (1 bis 2 Tage alten) werden durch Enthauptung getötet. </li><li> Trennen jedes Embryo nach dem vorhergehenden Elektroporation Annotation. Präparieren Sie das Gehirn unter einem Stereomikroskop und überprüfen unter dem Mikroskop grün fluoreszierende Signal (von der GFP-Reporter) in die entsprechende Region. </li><li> Der ausgewählte Gehirn kann &quot;frisch&quot; analysiert werden: fix das Gewebe für eine kurze Zeit in 4% Paraformaldehyd und einbetten in Agarose 4% oder in Gelatine-albumin, dann auf einem Abschnitt Vibratom-Typ (Abbildung 3). Nähere immunhistochemische Analyse (Abbildung 4), Kryo-schützen das Gehirn in 30% Saccharose-Lösung, in OCT Eindeckmediums (Tissue Tek) einzubetten dann schneiden 20 um Abschnitte in einem Kryostaten. </li></ol>

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<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
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<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Über der Narkose: Da in utero Elektroporation in den Hypothalamus kann technisch schwierig und erfordern längere Narkose Zeiten bevorzugen wir zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Verabreichung einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran. In unserer Erfahrung können Tiere bleiben entsprechend betäubt auf diese Weise für einen Zeitraum von bis zu einer Stunde mindestens, ist die Erholung der Mutter sehr schnell, und Embryo Überleben verbessert. Andere Ansätze zur Anästhesie zur Verfügung. Das ...

Genetische Manipulation des embryonalen Gehirn der Maus ist eine bevorzugte Ansatz über Entwicklungsregulation lernen. Die Erzeugung von mutierten Maus Linien ist jedoch langsam und teuer. Eine leistungsfähige Methode, um spezifische genetische Veränderungen in sich entwickelnden Neuronen des Gehirns von Säugetieren einzuführen, ist in utero Elektroporation. Im Wesentlichen besteht die Technik der DNA-Transfektion in die embryonalen Gehirn neuroepithelium mittels elektrischer Impulse, dann ermöglicht der Embryo für eine bestimmte Zeit überleben, sammeln das Gehirn und prüft sie auf mögliche neue, informative Phänotypen. Auf diese Weise kann der Experimentator Hypothesen fast sofort zu testen, ohne die langen Wartezeiten, die für die Produktion von Maus-Mutanten. Transfektion von DNA in sich entwickelnden Embryonen begann mit in ovo Elektroporation auf Hühnerembryonen 1. Der wesentliche Proof-of-Concept für die Maus wurde in Kultur durchgeführt <sup&gt; 2. Dies wurde bald von den ersten Beschreibungen der Technik auf der Maus in utero 3,4 gefolgt. Das Hauptproblem ist, das Gehirn des Embryos in der Gebärmutter entwickeln ohne sie zu töten oder die Mutter transfektieren. Lernen, um die notwendige Operation durchführen (Laparotomie, Injektion, die Elektroporation) erfordert eine lange Einarbeitungszeit. Sobald die Operation bis zu dem Punkt, wo der Embryo Überlebensverhältnis akzeptabel ist gemeistert, ist der nächste entscheidende Frage: Welche Hirnstrukturen zugänglich sind? Nicht überraschend, die ersten veröffentlichten Arbeiten zeigt erhaltenen Ergebnisse mit in utero Elektroporation auf die kortikale Entwicklung 5-9 konzentriert. Dies ist immer noch für die meisten Veröffentlichungen mit dieser Technik gilt, da der Bereich der Entwicklung Gehirn der Maus am besten zugänglichen chirurgischen Eingriffen ist der Kortex (Abbildung 1). Das Verfahren für die in utero Elektroporation in der Hirnrinde wurde beschriebenprint 10 und in Video 11-14. Eine Modifikation der Technik kann verwendet werden, um einen ventralen Teil des telencephalon, die Basalganglien 15 abzuzielen. Jenseits der telencephalon ist das Zwischenhirn (klassisch in Thalamus und Hypothalamus geteilt) eine Region des Vorderhirns mehr schwer zu erreichen. Eine kleine Anzahl von Papieren Berichte Targeting seiner Rückenflosse und am leichtesten zugängliche Teil, der Thalamus 16-19. Der Hypothalamus ist die ventralen Teil des Vorderhirns, damit die einen lokalisierten am tiefsten von der dorsalen Fläche (cortex) (Abbildung 1). Diese Region bleibt eine schwierige Herausforderung für die Forscher verpflichtet genetisch zu manipulieren das Gehirn der Maus in der Gebärmutter. Nach unserem Wissen, berichten nur sehr wenige Artikel über die Ergebnisse der in utero Transfektion in der Maus Hypothalamus 20,21. Allerdings ist die funktionelle Bedeutung des Hypothalamus cannot überbewertet werden, da sie Verhaltensweisen wie Essen und Trinken, Paarung, Aufzucht und Erziehung 22 regelt. Darüber hinaus tragen Veränderungen in Hypothalamus Entwicklung im späteren Leben Erkrankungen wie Übergewicht, Bluthochdruck, Diabetes und vorzeitige Pubertät 23 stammen. Die Möglichkeit, genetisch verändern die Hypothalamus während der Entwicklung würde ein sehr mächtiges Werkzeug, um es zu verstehen. Die grundlegende chirurgische Protokoll für die Laparotomie von schwangeren Mäusen, die wir verwenden hier ist ähnlich wie in anderen Protokollen 11,13,14,24 verwendet. Wir werden sie hier kurz beschreiben auf Vollständigkeit. Der Schlüssel zu unserem Verfahren, auf der anderen Seite, sind die Art der Anästhesie, der Ort der Injektion, die Art der Elektroden und das Einsetzen und Position der positiven Elektrode in bezug auf die Embryos Kopf. Wir bevorzugen zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Einatmen Gas über einfache intraperitoneale Anästhesie, seit der ehemalige ermöglicht dieetwas längere Narkose für eine schwierige Operation erforderlich. Isofluran Einatmen führt zu einer schnelleren Erholung von der Narkose, da in der Regel die Mutter zeigt ein normales Verhalten bereits Minuten nach der Operation. Die einfachste Punkt der Injektion der DNA-Lösung mit dem Glas-Mikropipette ist die laterale Ventrikel, was jedoch völlig ungeeignet Hypothalamus Elektroporation. Injektion direkt in den dritten Ventrikel ist in der Tat wichtig, tief Zwischenhirn Strukturen zielen. Es ist möglich, den Hypothalamus von E12.0 oder E12.5 mit Standard-, off-the-shelf Elektroden transfektieren. Wir haben einige der Elektroden durch Nepa Gene (Chiba, Japan) besonders zu diesem Zweck geeignet hergestellt gefunden. Mit unserem Verfahren erhalten wir Transfektion des gesamten Hypothalamus Neuroepithel oder teilweise, je nach regionalen Transfektion Elektrode Orientierung. Hier zeigen wir die Technik, durch Transfektion der mammillary Körper, wohldie tiefste und Einbau aller Hypothalamus Kerne. Darüber hinaus zeigen wir detaillierte histologische Analyse der transfizierten Zellen auf der zellulären Ebene der Auflösung. Ein Vergleich der in utero Elektroporation mit anderen Ansätzen zur Transfektion der Maus entwickelnde Gehirn in utero kann in der Diskussion Abschnitt gefunden werden.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>REAGENTS</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>nichtsteroidal entzündungshemmend</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>Braun</td><td>3887138</td><td>Povidon-Jod-Phosphat-Puffer</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (Buprenorphin)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>Opioid Analgetikum</td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Anästhesiegerät Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australien</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapillarabzieher P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>Vibratom-Gerät</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektrode 1</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Nadelelektrode aus Edelstahl, 10 mm-Spitze, Ø 0,5 mm</td></tr><tr><td>Elektrode 2</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Abdeckung Runde Platinplatte mit 4 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Faseroptische Kaltlichtquelle</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>Harvard Apparatur</td><td>GC120T-15</td><td>1,2 mm Außendurchmesser x 0,94 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Glasperlen-Sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Einspritzvorrichtung</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pneumatische Pico-Pumpe PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nahtfaden beschichtet Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Peritonealnaht</td></tr><tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Hautnaht</td></tr></tbody></table>

genetische manipulation der maus entwickeln hypothalamus durch<em&gt; in utero</em&gt; elektroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetische Modifikation von bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirn von Säugetieren ist ein sehr mächtiges experimentellen Ansatz. Die Erzeugung neuartiger Mausmutanten ist oft frustrierend langsam. Es wurde gezeigt, dass der Zugang zum Gehirn der Maus zu entwickeln in der Gebärmutter mit hinreichender Post-OP-Überleben möglich ist. Dennoch Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden fast ausschließlich für die meisten oberflächlich und leicht zugänglichen Teil des sich entwickelnden Gehirns gemeldet, dh die Rinde. Der Thalamus, ein schmaler und medialen Bereich, hat sich mehr schwer vorbei. Transfektion in tiefere Kerne, insbesondere diejenigen des Hypothalamus, ist vielleicht die größte Herausforderung und daher nur sehr wenige Ergebnisse gemeldet wurden. Hier zeigen wir ein Verfahren, um die gesamte Hypothalamus neuroepithelium oder ein Teil davon (Hypothalamus Regionen) für die Transfektion durch Elektroporation Ziel. Der Schlüssel zu unserem Ansatz sind länger Narkose mal, Injektion in den third Ventrikel und geeignete Art und die Positionierung der Elektroden. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse von Targeting und anschließende histologische Analyse der meisten vertieften Hypothalamus Kern, die mammillary Körper.

Die meisten Hypothalamus Neuronen zwischen E11.5 bis E15.2 geboren, nach der Geburt-dating-Analyse bei der Ratte 26 in die etwas kürzer Mausentwicklung 27,28 übersetzt. Der Gipfel des Hypothalamus Neurogenese bei E12.5 29-31 erreicht. Demgemäß wird zum Transfektion Alter für die vorliegende Studie (E12.5) gewählt wird, kann ein großer Teil der hypothalamischen Neuronen zu einem bestimmten rostro-kaudalen Niveau bezeichnet werden. Analyse bei E18.5 auf dicken ...

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus,<em&gt; In utero</em&gt; Genetische Manipulation seiner Entwicklung hat selten versucht worden. Wir zeigen ein detailliertes Verfahren für<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation in die Maus Hypothalamus und zeigen repräsentative Ergebnisse der vollständigen und teilweisen (regionalen) Hypothalamus Transfektion.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Plasmadesoxyribonukleinsäure (DNA) in den Hypothalamus von in der Gebärmutter sich entwickelnden Mausembryonen einzuschleusen, um die Funktion eines Zielgens zu aktivieren oder zu unterdrücken. Dies wird erreicht, indem zunächst die trächtige Maus anästhesiert und der Uterus durch eine Laparotomie freigelegt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die DNA-Lösung in das dritte Ventrikel des embryonalen Gehirns zu injizieren.Danach wird die positive Elektrode zwischen Plazenta und embryonalem Kopf innerhalb der Gebärmutter positioniert. Die negative Elektrode wird auf der äußeren Gebärmutteroberfläche platziert und elektrische Impulse werden appliziert. Der letzte Schritt besteht darin, die transfizierten embryonalen Gehirne sechs Tage später zu entnehmen.Schließlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die phänotypischen Veränderungen der transfizierten Zellen, deren Anzahl, Form, Position, Markerexpression usw. zu analysieren. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der viralen Transfektion sind erstens, dass keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen erforderlich sind, und zweitens, dass eine gezielte Bearbeitung einer spezifischen Region möglich ist. Und drittens ist mittels Ute-Elektroporation die Untersuchung von Kandidatengenen schneller. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da das Injizieren der DNA-Lösung in das dritte Ventrikel und das korrekte Positionieren der Nadelelektrode fortgeschrittene manuelle Geschicklichkeit sowie einige Erfahrung erfordern. Diese Methode kann helfen, Fragen im Bereich der hypothalamischen Entwicklung zu beantworten, insbesondere solche, die mit Zellwanderung sowie der genetischen Spezifizierung einzelner Regionen und Kerne zusammenhängen. Beginnen Sie dieses Verfahren damit, hochwertige Glas-Mikropipetten zu ziehen, da diese entscheidend sind, um die anfänglich hohe Abortrate aufgrund des Verlusts von Fruchtwasser zu verringern.Zur Vorbereitung der DNA lösen Sie die gereinigte, endotoxinfreie Plasmadna in PBS, der 0,1 % Fast Green zugesetzt wurde, auf eine Endkonzentration von ein bis zwei Mikrogramm pro Mikroliter. Das Fast Green macht die injizierte Lösung im embryonalen Hirnventrikel sichtbar. Füllen Sie anschließend 10 Mikroliter der DNA-Lösung in die Glas-Mikropipette.Verbinden Sie dann die Glas-Mikropipette mit dem Injektionssystem oder einer Mundpipette. Bereiten Sie in diesem Schritt den Operationstisch mit einer Heizplatte und den chirurgischen Instrumenten vor. Schalten Sie die Kaltlichtquellen ein, um die Sichtbarmachung der Embryonen zu erleichtern. Desinfizieren Sie anschließend die chirurgischen Instrumente mithilfe eines Glasperlensterilisators.Als Nächstes betäuben Sie eine trächtige Maus mit Isofluran. Nachdem die Maus betäubt wurde, tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern. Anschließend setzen Sie eine Maske auf das Gesicht, um die Anästhesie kontinuierlich aufrechtzuerhalten.Legen Sie die Maus nun mit dem Bauch nach oben auf eine Heizplatte. Sichern Sie ihren Körper, indem Sie die vier Gliedmaßen mit Klebeband fixieren. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig anästhesiert ist, indem Sie ihren Schwanz zur Überprüfung der Reflexe zwicken.Danach die Bauchoberfläche rasieren und mit einer Jodlösung desinfizieren. Einen etwa ein bis eineinhalb Zentimeter langen Längsschnitt in der Bauchhaut anlegen. Anschließend das Peritoneum durchtrennen.Legen Sie anschließend Mullbinde um den Schnitt. Spülen Sie die Binde mit PBS ab. Exponieren Sie ein Uterushorn, indem Sie es vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette herausziehen.Vermeiden Sie es, das Myometrium oder den Uterus stark zu spannen. Da ein hoher Druck im Uterus die Wahrscheinlichkeit eines Embryoflüssigkeitsverlusts während der Injektion erhöht, was zu einer Abtreibung führen kann. Legen Sie dann das Uterushorn auf mit PBS benetzte Mullkompresse und spülen Sie es alle paar Minuten mit PBS, um es feucht zu halten.Halten Sie den Uterus nun unter dem Mikroskop so, dass die Gehirnventrikel sichtbar sind. Verlagern Sie das Embryo, das in einer ungünstigen Position liegt, nicht stark. Dies erhöht nur die Wahrscheinlichkeit einer Abtreibung.Sehen Sie sich den Kopf des Embryos von oben an, um die Lücke zu finden, in der die Spalte zwischen den linken und rechten kortikalen Hemisphären liegt. Die Hemisphären sind leicht zu unterscheiden, und die seitlichen Ventrikel innerhalb von ihnen sind gewöhnlich als etwas dunklere Strukturen erkennbar. Wenn ein Embryo für die DNA-Injektion perfekt ausgerichtet ist, kann man die Uterusschleimhaut durchstoßen und direkt in das dritte Ventrikel eindringen.Halten Sie die Glas-Mikropipette mit der zuvor vorbereiteten DNA in einem Winkel von 45 Grad zur Uteruswand und durchstechen Sie diese am rostralen Ende des Interhemisphärenspalts, wobei eine Eindringtiefe von etwa einem Millimeter erreicht wird. Auf diese Weise gelangt die Spitze der Glas-Mikropipette in das dritte Ventrikel des Gehirns und nicht in das Seitenventrikel. Danach injizieren Sie etwa ein Mikroliter der DNA-Lösung in das dritte Ventrikel; bei einer gelungenen Injektion füllt sich das Ventrikel mit grüner Flüssigkeit. Wiederholen Sie denselben Vorgang mit allen Embryonen desselben Uterushorns.Dies ermöglicht eine gewisse Zeit, damit sich die DNA-Lösung gleichmäßig mit der Ventrikelflüssigkeit mischen und die gesamte neuroepitheliale Schicht erreichen kann. Schalten Sie nun den Elektroporator ein und stellen Sie die Einstellungen entsprechend dem embryonalen Alter ein. Verwenden Sie die nadelförmige Edelstahlelektrode als positive Elektrode und die runde flache Elektrode als negative Elektrode. Wählen Sie Embryonen mit der dorsalen Seite nach oben für die Elektroporation aus.Danach die Uteruswand neben dem Kopf des Embryos zwischen dem Amnion und der Plazenta durchstoßen, indem die Spitze der Nadelelektrode nach unten hindurchgeführt wird. Anschließend den Zeigefinger der anderen Hand als Gegenhalter verwenden. Etwa fünf Millimeter der Elektrodenspitze sollten sich zwischen dem Amnion und der Uteruswand auf Höhe des Mittelhirns befinden.Da dies die Ziel-Elektrode ist, bestimmt ihre Position, welcher Teil des hypothalamischen Neuroepithels am ehesten transfiziert wird. Positionieren Sie anschließend die runde, flache Elektrode mit der anderen Hand außerhalb der Uteruswand auf der gegenüberliegenden Seite des embryonalen Kopfes. Drücken Sie dann vorsichtig den Embryo zwischen den Elektroden zusammen. Verwenden Sie den Fußschalter, um die Spannung anzulegen. Ziehen Sie danach die Nadelelektrode langsam aus dem Uterus heraus, während Sie den Uterus mit dem Zeigefinger der anderen Hand zurückhalten. Wenn Fruchtwasser durch die durchstoßene Wand verloren geht, wird sich der Embryo in der Regel abstoßen.Nach der Injektion und Elektroporation aller Embryonen wird die Gebärmutter sehr vorsichtig zurück in den Bauchraum der Maus gelegt und genau so positioniert, wie sie zuvor war. Anschließend wird die Bauchhöhle mit Kochsalzlösung benetzt, bevor sie verschlossen wird. Die Bauchdecke wird mit chirurgischem Katgut vernäht, danach die Haut mit einer widerstandsfähigeren Naht.Desinfizieren Sie die Bauchoberfläche mit einer Jodlösung und spritzen Sie ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Mittel subkutan zur Schmerzlinderung. Danach entfernen Sie die Mutter aus der Narkosemaschine und stellen sie in einen Käfig, der mit einer Heizplatte beheizt wird. Überwachen Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat, und kontrollieren Sie sie täglich, um sicherzustellen, dass sie sich ohne Anzeichen von Infektion oder Schmerzen von dem Eingriff erholt.In diesem Schritt sammeln Sie die Embryonen oder Nachgeborenen entsprechend dem gewünschten Analysetag. Wählen Sie die Embryonen aus, die mit DNA injiziert und elektroporiert wurden, und dissezieren Sie die Gehirne unter diesem Stereomikroskop. Überprüfen Sie anschließend die gewünschte Region auf grünes fluoreszierendes Signal.Um das Gehirn des ausgewählten Embryos zu analysieren, fixieren Sie das Gewebe kurzzeitig in 4 % Paraldehyd. Anschließend einbetten in Agar 4 % oder in Gelatine-Albumin. Danach das Gehirn am Vibratom schneiden.Diese Abbildungen zeigen den Hypothalamus nach einer in-utero-Transfektion mit Plasmid-DNA, die fluoreszierende Reportergene, GFP oder CFP, zum Zeitpunkt E 12,5 trägt. Hierbei handelt es sich um einen sagittalen Schnitt, der einen vom rostralen bis zum kaudalen Bereich transfizierten Hypothalamus zeigt, sowie um einen Querschnitt mit markierten Zellen auf verschiedenen Ebenen entlang der mediale-lateralen Achse. Dieser sagittale Schnitt zeigt einen spezifisch transfizierten Mammillarkörper und die Markierung seines charakteristischen axonalen Baums, während auf der elektrischen Parade-Seite dieses Querschnitts ein markiertes Band entsprechend den am Tag E 12,5 geborenen Neuronen sichtbar ist.Um die Schnitte genauer zu analysieren, wurden horizontale Schnitte parallel zur Ebene der radialen glialen Fortsätze, die aus dem Mammillarrecessus hervorgehen, angefertigt. Die ambi O-Neurone, die aus dem Neuroepithel stammen und am Tag E 12,5 transfiziert wurden, wurden am Tag E 18,5 mittels Antikörper gegen GFP identifiziert.In diesem Beispiel markierte der Antikörper eine begrenzte Gruppe von MBO-Zellen. Diese Gruppe befand sich zwischen zwei nicht markierten lateralen und medialen MBO-Bereichen, die MBO-Neuronen entsprechen, die vor und nach E 12.5 geboren wurden, sowie der Ko-Imprägnierung mit einem Antikörper gegen Nestin. In Rot ist der Migrationsmodus einzelnen markierter Neuronen entlang radialer glialer Fortsätze des Neuroepithels dargestellt. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie bei korrekter Durchführung innerhalb von 30 Minuten durchgeführt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die DNA in das dritte Ventrikel injiziert und wie man die Nadel als positive Elektrode zwischen Embryo, Kopf und Plazenta positioniert, um den Hypothalamus effizient anzusteuern. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Immunhistochemie oder die *in situ*-Hybridisierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen bezüglich des Phänotyps der transfizierten Neurone zu beantworten.

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