Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch In utero Elektroporation

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Plasma-DNA in den Hypothalamus von Mausembryonen zu transfizieren, die sich in utero entwickeln, um die Funktion eines interessierenden Gens zu aktivieren oder zu unterdrücken. Dies wird erreicht, indem zuerst die trächtige Maus betäubt und die Gebärmutter durch Laparotomie freigelegt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die DNA-Lösung in den dritten Ventrikel des embryonalen Gehirns zu injizieren.

Als nächstes wird die positive Elektrode in der Gebärmutter zwischen Plazenta und Embryonalkopf positioniert. Die negative Elektrode wird auf die äußere Gebärmutteroberfläche aufgesetzt und es werden elektrische Impulse angelegt. Der letzte Schritt besteht darin, sechs Tage später die transfizierten embryonalen Gehirne zu entfernen.

Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die phänotypischen Veränderungen der transfizierten Zellen, Anzahl, Form, Position, Markerexpression usw. zu analysieren. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der viralen Transfektion sind erstens, dass sie keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen erfordert, und da es sich um zwei Einrichtungen handelt, ist zweitens eine gezielte Ausrichtung auf eine bestimmte Region möglich. Und drittens ist mit der Ute-Elektroporation das Screening von Kandidatengenen schneller.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Injektion der DNA-Lösung in den dritten Ventrikel und die richtige Positionierung der Nadelelektrode eine fortgeschrittene manuelle Verzerrung zusammen mit etwas Erfahrung erfordern. Diese Methode kann helfen, Fragen auf dem Gebiet der hypothalamischen Entwicklung zu beantworten, insbesondere solche, die für die Zellmigration relevant sind, sowie die Frage, wie einzelne Regionen und Zellkerne genetisch spezifiziert werden. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einige Mikropipetten aus gutem Glas ziehen, da diese unerlässlich sind, um die anfänglich hohe Abtreibungsrate aufgrund von Fruchtwasserverlust zu reduzieren.

Zur Aufbereitung der DNA wird die gereinigte endotoxinfreie Plasma-DNA in PBS mit einem Gehalt von 0,1 % schnellem Grün auf eine Endkonzentration von ein bis zwei Mikrogramm pro Mikroliter aufgelöst. Das schnelle Grün macht die injizierte Lösung in der embryonalen Hirnkammer sichtbar. Laden Sie als Nächstes 10 Mikroliter der DNA-Lösung in die Mikropipette aus Glas.

Anschließend wird die Mikropipette aus Glas an das Injektionssystem oder eine Mundpipette angeschlossen. Bereiten Sie in diesem Schritt den Operationstisch mit einem Heizkissen vor und die chirurgischen Instrumente Schalten Sie die Kaltlichtquellen ein, um die Visualisierung der Embryonen zu erleichtern. Desinfizieren Sie anschließend die chirurgischen Instrumente mit einem Glasperlensterilisator.

Als nächstes betäuben Sie eine trächtige Maus mit Isof-Fluor. Nachdem die Maus betäubt wurde, tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Setzen Sie die Maske anschließend auf das Gesicht, um die Anästhesie kontinuierlich aufrechtzuerhalten.

Lege nun die Maus mit dem Bauch nach oben auf ein Heizkissen. Befestigen Sie seinen Körper, indem Sie seine vier Gliedmaßen mit Klebeband fixieren. Stellen Sie sicher, dass die Maus vollständig betäubt ist, indem Sie ihren Schwanz für Reflux einklemmen.

Rasieren Sie dann die Bauchoberfläche und desinfizieren Sie sie mit Jodlösung. Machen Sie einen etwa ein bis eineinhalb Zentimeter langen Längsschnitt auf der Bauchhaut. Schneiden Sie anschließend das Bauchfell.

Legen Sie als nächstes Baumwollgaze um den Einschnitt. Spülen Sie die Gaze mit PBS aus. Lege ein Uterushorn frei, indem du es vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette herausziehst.

Vermeiden Sie es, das Myometrium oder die Gebärmutter fest zu ziehen. Da ein hoher Druck in der Gebärmutter die Wahrscheinlichkeit eines Flüssigkeitsverlusts des Embryos bei der Injektion erhöht, der zu einer Abtreibung führt. Legen Sie dann das Gebärmutterhorn auf eine mit PBS gespülte Gaze und spülen Sie es alle paar Minuten mit PBS aus, um es feucht zu halten.

Halten Sie nun unter dem Mikroskop die Gebärmutter so, dass die Hirnventrikel sichtbar gemacht werden können. Positionieren Sie den Embryo, der in einer ungünstigen Position liegt, nicht großflächig. Das erhöht nur die Chancen auf einen Schwangerschaftsabbruch.

Schauen Sie sich den Kopf des Embryos von oben an, um die Lücke zwischen der linken und rechten kortikalen Hemisphäre zu lokalisieren. Die Hemisphären sind leicht zu unterscheiden, die Seitenventrikel im Inneren können meist als etwas dunklere Formen wahrgenommen werden. Wenn sich herausstellt, dass ein Embryo perfekt für die DNA-Injektion ausgerichtet ist, ist es möglich, die Gebärmutterwand zu durchstechen und sofort in den dritten Ventrikel einzudringen.

Halten Sie die Mikropipette aus Glas mit der zuvor vorbereiteten DNA in einem Winkel von 45 Grad an die Gebärmutterwand und punktieren Sie sie am rostralen Ende der interhemisphärischen Fissur, wobei Sie bis zu einer Tiefe von etwa einem Millimeter eindringen. Auf diese Weise gelangt die Spitze der Mikropipette aus Glas in den dritten Ventrikel des Gehirns und nicht in den Seitenventrikel. Nachdem Sie etwa einen Mikroliter DNA-Lösung in den dritten Ventrikel injiziert haben, füllt grüne Flüssigkeit den Ventrikel in einer guten Injektion, wiederholen Sie den gleichen Vorgang mit allen Embryonen desselben Gebärmutterhorns.

Dies gibt der DNA-Lösung einige Zeit, sich gleichmäßig mit der Ventrikelflüssigkeit zu vermischen und das gesamte Neuroepithel zu erreichen. Schalten Sie nun den Elektroperter ein und passen Sie die Einstellungen entsprechend dem Embryonalalter an. Verwenden Sie die Nadelelektrode aus Edelstahl als Pluspol und die runde Flachelektrode als Minuspol, wählen Sie die Embryonen mit der Rückenseite nach oben für die Elektroporation aus.

Stechen Sie dann die Gebärmutterwand neben dem Kopf des Embryos zwischen Fruchtblase und Plazenta durch, indem Sie die Spitze der Nadelelektrode nach unten schieben. Benutze dann den Zeigefinger der anderen Hand als Schubblock. Etwa fünf Millimeter der Elektrodenspitze sollten sich zwischen der Fruchtblase und der Gebärmutterwand in etwa auf Höhe des Mittelhirns befinden.

Da es sich um die Zielelektrode handelt, bestimmt ihre Position, welcher Teil des hypothalamischen Neuroepithels am wahrscheinlichsten transfiziert wird. Positionieren Sie dann mit der anderen Hand die runde, flache Elektrode außerhalb der Gebärmutterwand auf der gegenüberliegenden Seite des Kopfes des Embryos. Drücken Sie dann den Embryo vorsichtig zwischen die Elektroden.

Verwenden Sie den Pedalschalter, um eine Spannung anzulegen. Ziehen Sie danach die Nadelelektrode langsam aus der Gebärmutter heraus, während Sie die Gebärmutter mit dem Zeigefinger der anderen Hand zurückhalten. Wenn Fruchtwasser durch die punktierte Wand verloren geht, wird der Embryo in der Regel abgetrieben.

Nach der Injektion und Elektroporation aller Embryonen setzen Sie die Gebärmutter sehr vorsichtig wieder in den Bauch der Maus ein und positionieren sie genau so, wie sie vorher waren. Befeuchten Sie dann die Bauchhöhle mit Kochsalzlösung, bevor Sie sie schließen. Nähen Sie das Bauchfell mit einem chirurgischen Katzendarm und nähen Sie dann die Haut mit einer widerstandsfähigeren Naht.

Desinfizieren Sie die Bauchoberfläche mit Jodlösung und injizieren Sie ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Mittel subkutan zur Schmerzlinderung. Nehmen Sie dann die Mutter aus dem Anästhesiegerät und legen Sie sie in einen Käfig, der mit einem Heizkissen beheizt wird. Überwachen Sie die Maus, bis sie sich vollständig von der Narkose erholt hat, und kontrollieren Sie sie täglich, um sicherzustellen, dass sie sich ohne Anzeichen von Infektionen oder Schmerzen von dem Eingriff erholt.

In diesem Schritt werden die Embryonen oder Postnatalen entsprechend dem gewünschten Tag der Analyse entnommen. Wählen Sie die Embryonen aus, die mit DNA injiziert und elektroporiert wurden, und präparieren Sie die Gehirne unter diesem Stereomikroskop. Überprüfen Sie dann, ob das grüne Fluoreszenzsignal in der entsprechenden Region

Um das Gehirn des ausgewählten Embryos zu analysieren, fixieren Sie das Gewebe für kurze Zeit in 4% Paraldehyd. Als nächstes betten Sie es in aros 4% oder in Gelatinealbumin ein. Schneide dann das Gehirn auf dem Vibrato.

Diese Abbildungen zeigen den Hypothalamus nach in utero-Transfektion von Plasma-DNA, die fluoreszierende Reportergene, GFP oder CFP bei E 12,5 trägt. Dies ist ein sagittaler Schnitt, der einen Hypothalamus zeigt, der von rostral nach verhätschelt transfiziert wurde, und hier ist der Querschnitt mit den markierten Zellen auf verschiedenen Ebenen entlang der lateralen Achse des Mediums. Dieser sagittale Schnitt zeigt einen spezifisch transfizierten Mammillarkörper und die Beschriftung seines charakteristischen Axonbaums, und auf der Elektroparadeseite dieses Querschnitts ist ein markiertes Band zu sehen, das Neuronen entspricht, die auf E 12.5 geboren wurden.

Um die Abschnitte näher zu analysieren. Die horizontalen Schnitte, die parallel zur Ebene der radialen Gliafortsätze verlaufen, die von der Mammillarrecession ausgehen, wurden präpariert. Die Ambi O-Neuronen, die aus Neuroepithel geboren wurden, das am Tag E 12.5 transfiziert wurde, wurden am Tag E 18.5 mittels Antikörpern gegen GFP identifiziert.

In diesem Beispiel markierte der Antikörper eine eingeschränkte Gruppe von MBO-Zellen. Diese Gruppe befand sich zwischen zwei unmarkierten lateralen und medialen MBO-Arealen, die MBO-Neuronen entsprechen, die vor und nach E 12.5 geboren wurden, und der Co-Färbung mit einem Antikörper gegen Neston. In Rot ist der Migrationsmodus von individuell markierten Neuronen auf radialen Gliafortsätzen des Neuroepithels dargestellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die DNA in den dritten Ventrikel injiziert wird und wie Sie die Nadel als positive Elektrode zwischen Embryo, Kopf und Plazenta positionieren, um den Hypothalamus effizient zu erreichen. Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden wie Immunhistochemie oder Inid-Hybridisierung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zum Phänotyp der transfizierten Neuronen zu beantworten.