Name: Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch In utero Elektroporation (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-07-24T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Lernen Sie die In-utero-Elektroporation zur genetischen Manipulation des Hypothalamus bei Maus-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Transfektion von DNA in das dritte Ventrikel zur Untersuchung hypothalamischer Entwicklung.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.

1. Herstellung von DNA und Glasmikropipetten zur Injektion <ol><li> Gute Qualität Glasmikropipetten sind unerlässlich, um anfängliche hohe Rate der Fehlgeburten durch den Verlust von Fruchtwasser zu reduzieren. Das Verfahren zur Glasmikropipetten ziehen ist gut 13,18,25 dokumentiert. Mit 1,2 mm Durchmesser gezogen Kapillaren in einem herkömmlichen Sutter P-97-Gerät mit den Einstellungen P = 500; Wärme = 300; Ziehen = 40; Velocity = 50; Zeit = 50. Den Abzieher mit 3 mm &quot;Trog&quot; Filamente (Sutter Instrument FT330B). Die 2 mm Größe Filamente für uns weniger zufriedenstellende Ergebnisse lieferte. Auf der anderen Seite, hat Abschrägung des Mikropipettenspitzen nicht scheinen, um für uns zu verbessern. </li><li> Auflösen gereinigt endotoxinfreiem Plasmid-DNA in PBS (Zellkultur), die 0,1% Fast Green bis zu einer Endkonzentration von 1 bis 2 pg / pl. Die Fast Green machen den injizierten Lösung sichtbar im embryonalen Hirn Ventrikel. </li><li> Legen Sie 10 ul der DNA-Lösung in die Glasmikropipette. </li&gt; <li> Schließen Sie das Glasmikropipette dem Einspritzsystem (Pico Pump) oder Mund Pipette. </li></ol> 2. Anästhesie Vorbereiten des Operationstisches mit einem Heizkissen und der chirurgischen Instrumente. Schalten Sie die kalte Lichtquellen, um die Visualisierung der Embryonen zu erleichtern. Desinfizieren Sie die chirurgischen Instrumente mit zum Beispiel eine Glasperle Sterilisator. Drei verschiedene Anästhesieverfahren sind für dieses Protokoll möglich (siehe Diskussion). Hier beschreiben wir die, die wir für die besten halte, mit Isofluran Inhalation für Narkose (Durchfluss 0,5 l / min) sowie die Wartung (Durchfluss 1 L / min). <ol><li> Führen Sie die Maus schwanger in einem kleinen transparenten (so die Maus bleibt sichtbar) Behälter mit dem Komesaroff Mark 5 Narkosegerät durch eine kurze Rohrlänge. </li><li> Füllen Sie den Verdampfer mit Isofluran, öffnen Sie dann die Sauerstoff-Flasche an das Gerät angeschlossen. Brennen Sie eine oder zwei Impulse isoflUrane / Sauerstoff (0,5 L / min) in den Behälter mit der Maus und Uhr für Narkose um in. </li><li> Nehmen Sie die Maus aus, bedecken ihre Augen mit Salbe zu verhindern, dass sie vor dem Austrocknen und passen die Flow-Anästhesie-Maske auf den Kopf sofort. </li></ol> 3. Laparotomie <ol><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bauch nach oben Heizkissen (sonst seine Körpertemperatur sinken wird sehr schnell abnimmt Heilungschancen) und sichern ihren Körper in Ort durch die Festsetzung seiner vier Beine an den Seiten mit Klebeband. Beurteilen Sie die Tiefe der Narkose, indem für den Verlust der Reaktion auf Reflexstimulation (zB Zeh oder Schwanz Prise mit festem Druck). </li><li> Rasur der Bauchdecke und desinfizieren sie mit dem iodophorpovidone-Iod (Braunoderm). </li><li> Einen Längsschnitt (1 bis 1,5 cm lang) auf der Bauchhaut. Dann schneiden Sie das Bauchfell. Zeigen Baumwolle Gaze um den Einschnitt. Machen Sie einen Uterushorns sichtbar und ziehen Sie es vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette auf die PBS gespült gauze. Spülen Sie die Gebärmutter mit PBS sehr oft, damit es immer angefeuchtet (2A und 2B). Während des gesamten Verfahrens zu vermeiden Ziehen des Mesometrium oder die Gebärmutter eng, da hohe Druck in der Gebärmutter für den Embryo Erhöhung der Chancen der Verlust von Flüssigkeit beim Einspritzen was Abtreibung übertragen wird. </li></ol> 4. DNA-Injektion in das Gehirn Ventrikel <ol><li> Halten des Uterus in einer Weise, dass die Hirnkammern visualisiert werden kann. Nicht umfassend neu ein Embryo, der sich in einer ungünstigen Position liegt - das erhöht nur die Chancen der Abtreibung. </li><li> Ein Blick auf die Embryo Kopf von oben, die Lücke visuell lokalisieren oder Riss zwischen den linken und rechten kortikalen Hemisphären. Die Halbkugeln sind leicht zu unterscheiden und die lateralen Ventrikel in ihnen (nicht ins Visier genommen werden) können in der Regel als etwas dunkler Formen wahrgenommen werden. Wenn ein Embryo sich als optimaler Ausrichtung zur DNA-Injektion (Figures 2C und 2D), ist es möglich, die Gebärmutterwand durchstoßen und in die dritte Kammer auf einmal. Halten der Glas-Mikropipette auf 45 ° an der Gebärmutterwand und durchstechen am rostralen Ende des Spalts zwischen kortikalen Halbkugeln, dringt etwa 1 mm. Auf diese Weise wird die Spitze des Glas-Mikropipette wird in die dritte Ventrikel des Gehirns (nicht die lateralen Ventrikel) (2C und 2D). In Embryonen ungünstiger orientiert ist es sinnvoll, zunächst durchbohren der Gebärmutterwand (immer bei 45 °) in der Nähe des embryonalen Kopf, legen Sie die Mikropipettenspitze in die richtige Position zwischen den kortikalen Hemisphären und erst dann zu perforieren das Gehirn. Spritzen etwa 1 ul DNA-Lösung in den dritten Ventrikel (eine gute Injektion füllt die Ventrikel mit grünen Flüssigkeit). Wiederholen Sie diesen Vorgang mit allen Embryonen von einem Uterus Horn. Dies ermöglicht einige Zeit für die DNA-Lösung gleichmäßig zu mischen mit dem ventrikulären Flüssigkeit und erreichen die Zellstofe Neuroepithel. </li></ol> 5. Targeting der Hypothalamus für die Elektroporation <ol><li> Schalten Sie das Elektroporator auf und passen Sie die Einstellungen entsprechend der embryonalen Alter (für E12.5 verwenden wir 5 Rechteck-Pulse, 50 V, 50 ms ON/950 ms OFF). Verwendung Pluspol der Edelstahl Nadelelektrode (CUY550-10) und als negativer Pol einer runden flachen Elektrode (CUY700P4L). (Es ist wichtig, dass die Elektroden kleiner als die Embryos sind, da sonst der Strom nur fließt, um den Embryo, aber nicht durch sie.) </li><li> Wählen Sie für die Elektroporation jene Embryonen, deren dorsalen Seite nach oben (dh wandte sich dem Experimentator) (wie die meisten von ihnen sind), und entsorgen Sie diejenigen, deren Ausrichtung ist nicht günstig. Jetzt ist es sicher, um die Gebärmutter mit Ethanol desinfiziert Finger oder mit Handschuhen berühren. Halten des Uterus mit einer Pinzette, würde jedoch der Stromfluss bei der Elektroporation stören. </li><li> Pierce die Gebärmutterwand durch das Embryonenschutzgesetz den Kopf zwischen dem amniotic sac und der Plazenta in Abstützung nach unten durch sie mit der Spitze der Nadelelektrode. Verwenden Sie den Zeigefinger der anderen Hand als Widerlager. Über 5 mm von der Elektrodenspitze muss nun zwischen der Fruchtblase und der Gebärmutterwand, etwa auf dem Niveau des Mittelhirns (2E und 2F). Denken Sie daran, dass dies das &quot;Targeting Elektrode&quot; ist, so wird seine Position zu bestimmen, welcher Teil des Hypothalamus Neuroepithel höchstwahrscheinlich transfiziert bekommen ist. Der Embryo muss sehr vorsichtig &quot;gequetscht&quot; zwischen den Elektroden. </li><li> Mit der anderen Hand, positionieren Sie den runden flachen Elektrode außerhalb der Gebärmutter Wand auf der gegenüberliegenden Seite des Embryos Kopf (2E und 2G). </li><li> Verwenden Sie den Fußschalter, um Spannung anzulegen (50 V, 50 ms ON, 950 ms AUS, 5 Rechteckpulse). </li><li> Langsam ziehen die Nadel-Elektrode aus der Gebärmutter, während die Gebärmutter wieder mit dem Zeigefinger der anderen Hand - wenn amniotic Flüssigkeit durch den durchlöcherten Wand verloren geht, in der Regel der Embryo unterziehen Abtreibung. Wiederholen Sie den Vorgang mit allen Embryonen. </li><li> Bringen Sie den Uterushorns in den Bauch und wiederholen Sie die Injektion und Elektroporation in den Überrest Horn. </li></ol> 6. Finishing der Chirurgie <ol><li> Nach der Injektion und Elektroporation von allen Embryonen, legen die Gebärmutter wieder in den Bauch sehr sorgfältig, exakt positioniert, wie sie vor und feucht die Bauchhöhle mit Kochsalzlösung vor dem Schließen waren. </li><li> Naht das Bauchfell mit Catgut (Vicryl Polyglactin 910, 5-0, Ethicon V4914). Für die Schließung der Haut Verwendung &quot;unterbrochen Stich&quot; methodwith ein beständiger Naht (Supramid Nylon, 6-0, Serag Wiessner TO 07171L). </li><li> Desinfizieren Sie die Bauch Oberfläche mit PVP-Jod (Braunoderm) und injizieren eine nicht-steroidalen entzündungshemmenden subkutan (z. B. 100 ul einer Lösung von 1.10 Rimadyl in 0,9% NaCl) oder, noch besser, ein Opioid wie buprenorphine (Temgesic, 0,05 bis 0,1 mg / kg Körpergewicht in 0,9% NaCl), um Schmerzen zu lindern. </li><li> Entfernen Sie die Mutter aus der Narkose Maschine und legen Sie sie in einem Käfig, die von einem Heizkissen erwärmt wird. Überwachen Sie die Maus ständig, bis sie vollständig aus der Narkose erholt. Später, überprüfen Sie die Tiere täglich um sicherzustellen, dass sie von dem Verfahren ohne Anzeichen einer Infektion oder Schmerzen erholt. </li></ol> 7. Analyse der Ergebnisse <ol><li> Ernten der Embryos (oder postnatals) entsprechend der gewünschten Tag der Analyse. Postnatale Mäuse (1 bis 2 Tage alten) werden durch Enthauptung getötet. </li><li> Trennen jedes Embryo nach dem vorhergehenden Elektroporation Annotation. Präparieren Sie das Gehirn unter einem Stereomikroskop und überprüfen unter dem Mikroskop grün fluoreszierende Signal (von der GFP-Reporter) in die entsprechende Region. </li><li> Der ausgewählte Gehirn kann &quot;frisch&quot; analysiert werden: fix das Gewebe für eine kurze Zeit in 4% Paraformaldehyd und einbetten in Agarose 4% oder in Gelatine-albumin, dann auf einem Abschnitt Vibratom-Typ (Abbildung 3). Nähere immunhistochemische Analyse (Abbildung 4), Kryo-schützen das Gehirn in 30% Saccharose-Lösung, in OCT Eindeckmediums (Tissue Tek) einzubetten dann schneiden 20 um Abschnitte in einem Kryostaten. </li></ol>

<ol><li>Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shocking%27+developments+in+chick+embryology%3A+electroporation+and+in+ovo+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression.</a> Nat. Cell Biol. 1, E203-E207 (1999).</li>
<li>Miyasaka, N., Arimatsu, Y., Takiguchihayashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foreign+gene+expression+in+an+organotypic+culture+of+cortical+anlage+after+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Foreign gene expression in an organotypic culture of cortical anlage after in vivo electroporation.</a> Neuroreport. 10, 2319-2323 (1999).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation%3A+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neocortex+patterning+by+the+secreted+signaling+molecule+FGF8%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neocortex patterning by the secreted signaling molecule FGF8.</a> Science. 294, 1071-1074 (2001).</li>
<li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+tend+to+stop+migration+and+differentiate+along+the+cortical+internal+plexiform+zones+in+the+Reelin+signal-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurons tend to stop migration and differentiate along the cortical internal plexiform zones in the Reelin signal-deficient mice.</a> J. Neurosci. Res. 69, 723-730 (2002).</li>
<li>Fukuchi-Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emx2+patterns+the+neocortex+by+regulating+FGF+positional+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Emx2 patterns the neocortex by regulating FGF positional signaling.</a> Nat. Neurosci. 6, 825-831 (2003).</li>
<li>Shimogori, T., Banuchi, V., Ng, H. Y., Strauss, J. B., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+signaling+centers+expressing+BMP%2C+WNT+and+FGF+proteins+interact+to+pattern+the+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Embryonic signaling centers expressing BMP, WNT and FGF proteins interact to pattern the cerebral cortex.</a> Development. 131, 5639-5647 (2004).</li>
<li>Shimogori, T., Grove, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+growth+factor+8+regulates+neocortical+guidance+of+area-specific+thalamic+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fibroblast growth factor 8 regulates neocortical guidance of area-specific thalamic innervation.</a> J. Neurosci. 25, 6550-6560 (2005).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat. Protoc. 1, 1552-1558 (2006).</li>
<li>Dixit, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Delivery+into+Multiple+CNS+Territories+Using+In+Utero+Electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Delivery into Multiple CNS Territories Using In Utero Electroporation.</a> J. Vis. Exp. (52), e2957(2011).</li>
<li>Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+Electroporation+followed+by+Primary+Neuronal+Culture+for+Studying+Gene+Function+in+Subset+of+Cortical+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons.</a> J. Vis. Exp. (44), e2103(2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E15+Mouse+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E15 Mouse Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Walantus, W., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Utero+Intraventricular+Injection+and+Electroporation+of+E16+Rat+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In Utero Intraventricular Injection and Electroporation of E16 Rat Embryos.</a> J. Vis. Exp. (6), e236(2007).</li>
<li>Borrell, V., Yoshimura, Y., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+delivery+to+telencephalic+inhibitory+neurons+by+directional+in+utero+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Targeted gene delivery to telencephalic inhibitory neurons by directional in utero electroporation.</a> J. Neurosci. Methods. 143, 151-158 (2005).</li>
<li>Haddad-Tovolli, R., Heide, M., Zhou, X., Blaess, S., Alvarez-Bolado, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+thalamic+differentiation%3A+gli-dependent+pattern+and+gli-independent+prepattern%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.</a> Front Neurosci. 6, 27(2012).</li>
<li>Kataoka, A., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf8+controls+regional+identity+in+the+developing+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf8 controls regional identity in the developing thalamus.</a> Development. 135, 2873-2881 (2008).</li>
<li>Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+in+Utero+Electroporation%3A+Controlled+Spatiotemporal+Gene+Transfection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection.</a> J. Vis. Exp. (54), e3024(2011).</li>
<li>Vue, T. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+signaling+controls+thalamic+progenitor+identity+and+nuclei+specification+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog signaling controls thalamic progenitor identity and nuclei specification in mice.</a> J. Neurosci. 29, 4484-4497 (2009).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+the+hypocretin%2Forexin+gene+by+NR6A1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of the hypocretin/orexin gene by NR6A1.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 403, 178-183 (2010).</li>
<li>Tsuchiya, R., Takahashi, K., Liu, F. C., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+axonal+projections+from+mammillary+bodies+in+Pax6+mutant+mice%3A+possible+roles+of+Netrin-1+and+Slit+2+in+mammillary+projections%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Res%22%5BJournal%5D)">Aberrant axonal projections from mammillary bodies in Pax6 mutant mice: possible roles of Netrin-1 and Slit 2 in mammillary projections.</a> J. Neurosci. Res. 87, 1620-1633 (2009).</li>
<li>Canteras, N. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCanteras%2C+NS+%22The+Mouse+Nervous+System%22">The Mouse Nervous System</a>. Watson, C., Paxinos, G., Puelles, L. , Academic Press. 539-562 (2011).</li>
<li>Caqueret, A., Yang, C., Duplan, S., Boucher, F., Michaud, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+for+trouble%3A+a+search+for+developmental+defects+of+the+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Res%22%5BJournal%5D)">Looking for trouble: a search for developmental defects of the hypothalamus.</a> Horm. Res. 64, 222-230 (2005).</li>
<li>Petros, T. J., Rebsam, A., Mason, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+and+ex+vivo+Electroporation+for+Gene+Expression+in+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero and ex vivo Electroporation for Gene Expression in Mouse Retinal Ganglion Cells.</a> J. Vis. Exp. (31), e1333(2009).</li>
<li>Nijagal, A., Le, T., Wegorzewska, M., Mackenzie, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mouse+Model+of+in+Utero+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Mouse Model of in Utero Transplantation.</a> J. Vis. Exp. (47), e2303(2011).</li>
<li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+the+Rat+Hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Anat.+Embryol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Development of the Rat Hypothalamus.</a> Adv. Anat. Embryol. Cell Biol. 100, 1-178 (1986).</li>
<li>Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+developmental+time+across+mammalian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Translating developmental time across mammalian species.</a> Neuroscience. 105, 7-17 (2001).</li>
<li>Clancy, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Web-based+method+for+translating+neurodevelopment+from+laboratory+species+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroinformatics%22%5BJournal%5D)">Web-based method for translating neurodevelopment from laboratory species to humans.</a> Neuroinformatics. 5, 79-94 (2007).</li>
<li>Ishii, Y., Bouret, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+birthdate+of+hypothalamic+leptin-activated+neurons+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Embryonic birthdate of hypothalamic leptin-activated neurons in mice.</a> Endocrinology. 153, 3657-3667 (2012).</li>
<li>Karim, M. A., Sloper, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histogenesis+of+the+supraoptic+and+paraventricular+neurosecretory+cells+of+the+mouse+hypothalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Histogenesis of the supraoptic and paraventricular neurosecretory cells of the mouse hypothalamus.</a> J. Anat. 130, 341-347 (1980).</li>
<li>Shimada, M., Nakamura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+of+neuron+origin+in+mouse+hypothalamic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Time of neuron origin in mouse hypothalamic nuclei.</a> Exp. Neurol. 41, 163-173 (1973).</li>
<li>Alvarez-Bolado, G., Paul, F. A., Blaess, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+lineage+in+the+mouse+hypothalamus%3A+from+progenitor+domains+to+hypothalamic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Neural.+Dev%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog lineage in the mouse hypothalamus: from progenitor domains to hypothalamic regions.</a> Neural. Dev. 7, 4(2012).</li>
<li>Vann, S. D., Aggleton, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mammillary+bodies%3A+two+memory+systems+in+one%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The mammillary bodies: two memory systems in one.</a> Nat. Rev. Neurosci. 5, 35-44 (2004).</li>
<li>Gratsch, T. E., De Boer, L. S., O'Shea, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+inhibition+of+BMP-4+gene+expression+in+postimplantation+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">RNA inhibition of BMP-4 gene expression in postimplantation mouse embryos.</a> Genesis. 37, 12-17 (2003).</li>
<li>Wu, N., Yu, A. B., Zhu, H. B., Lin, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+silencing+of+Sry+gene+with+RNA+interference+in+developing+mouse+embryos+resulted+in+feminization+of+XY+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Effective silencing of Sry gene with RNA interference in developing mouse embryos resulted in feminization of XY gonad.</a> J. Biomed. Biotechnol. 2012, 343891(2012).</li>
<li>Kikuchi, N., Nakamura, S., Ohtsuka, M., Kimura, M., Sato, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanism+of+gene+transfer+into+early+to+mid-gestational+mouse+fetuses+by+tail+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Possible mechanism of gene transfer into early to mid-gestational mouse fetuses by tail vein injection.</a> Gene Ther. 9, 1529-1541 (2002).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat. Biotechnol. 27, 59-65 (2009).</li>
<li>Xin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+targeting+mechanism+of+Angiopep-conjugated+poly%28ethylene+glycol%29-co-poly%28epsilon-caprolactone%29+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The brain targeting mechanism of Angiopep-conjugated poly(ethylene glycol)-co-poly(epsilon-caprolactone) nanoparticles.</a> Biomaterials. 33, 1673-1681 (2012).</li>
<li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li>
<li>Kaufman, R. J., Davies, M. V., Wasley, L. C., Michnick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+vectors+for+stable+expression+of+foreign+genes+in+mammalian+cells+by+use+of+the+untranslated+leader+sequence+from+EMC+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Improved vectors for stable expression of foreign genes in mammalian cells by use of the untranslated leader sequence from EMC virus.</a> Nucleic Acids Res. 19, 4485-4490 (1991).</li>
<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The green fluorescent protein.</a> Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).</li>
<li>Londrigan, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+promoters+for+driving+efficient+transgene+expression+in+neonatal+porcine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Xenotransplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of promoters for driving efficient transgene expression in neonatal porcine islets.</a> Xenotransplantation. 14, 119-125 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Über der Narkose: Da in utero Elektroporation in den Hypothalamus kann technisch schwierig und erfordern längere Narkose Zeiten bevorzugen wir zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Verabreichung einer Mischung aus Sauerstoff und Isofluran. In unserer Erfahrung können Tiere bleiben entsprechend betäubt auf diese Weise für einen Zeitraum von bis zu einer Stunde mindestens, ist die Erholung der Mutter sehr schnell, und Embryo Überleben verbessert. Andere Ansätze zur Anästhesie zur Verfügung. Das ...

Genetische Manipulation des embryonalen Gehirn der Maus ist eine bevorzugte Ansatz über Entwicklungsregulation lernen. Die Erzeugung von mutierten Maus Linien ist jedoch langsam und teuer. Eine leistungsfähige Methode, um spezifische genetische Veränderungen in sich entwickelnden Neuronen des Gehirns von Säugetieren einzuführen, ist in utero Elektroporation. Im Wesentlichen besteht die Technik der DNA-Transfektion in die embryonalen Gehirn neuroepithelium mittels elektrischer Impulse, dann ermöglicht der Embryo für eine bestimmte Zeit überleben, sammeln das Gehirn und prüft sie auf mögliche neue, informative Phänotypen. Auf diese Weise kann der Experimentator Hypothesen fast sofort zu testen, ohne die langen Wartezeiten, die für die Produktion von Maus-Mutanten. Transfektion von DNA in sich entwickelnden Embryonen begann mit in ovo Elektroporation auf Hühnerembryonen 1. Der wesentliche Proof-of-Concept für die Maus wurde in Kultur durchgeführt <sup&gt; 2. Dies wurde bald von den ersten Beschreibungen der Technik auf der Maus in utero 3,4 gefolgt. Das Hauptproblem ist, das Gehirn des Embryos in der Gebärmutter entwickeln ohne sie zu töten oder die Mutter transfektieren. Lernen, um die notwendige Operation durchführen (Laparotomie, Injektion, die Elektroporation) erfordert eine lange Einarbeitungszeit. Sobald die Operation bis zu dem Punkt, wo der Embryo Überlebensverhältnis akzeptabel ist gemeistert, ist der nächste entscheidende Frage: Welche Hirnstrukturen zugänglich sind? Nicht überraschend, die ersten veröffentlichten Arbeiten zeigt erhaltenen Ergebnisse mit in utero Elektroporation auf die kortikale Entwicklung 5-9 konzentriert. Dies ist immer noch für die meisten Veröffentlichungen mit dieser Technik gilt, da der Bereich der Entwicklung Gehirn der Maus am besten zugänglichen chirurgischen Eingriffen ist der Kortex (Abbildung 1). Das Verfahren für die in utero Elektroporation in der Hirnrinde wurde beschriebenprint 10 und in Video 11-14. Eine Modifikation der Technik kann verwendet werden, um einen ventralen Teil des telencephalon, die Basalganglien 15 abzuzielen. Jenseits der telencephalon ist das Zwischenhirn (klassisch in Thalamus und Hypothalamus geteilt) eine Region des Vorderhirns mehr schwer zu erreichen. Eine kleine Anzahl von Papieren Berichte Targeting seiner Rückenflosse und am leichtesten zugängliche Teil, der Thalamus 16-19. Der Hypothalamus ist die ventralen Teil des Vorderhirns, damit die einen lokalisierten am tiefsten von der dorsalen Fläche (cortex) (Abbildung 1). Diese Region bleibt eine schwierige Herausforderung für die Forscher verpflichtet genetisch zu manipulieren das Gehirn der Maus in der Gebärmutter. Nach unserem Wissen, berichten nur sehr wenige Artikel über die Ergebnisse der in utero Transfektion in der Maus Hypothalamus 20,21. Allerdings ist die funktionelle Bedeutung des Hypothalamus cannot überbewertet werden, da sie Verhaltensweisen wie Essen und Trinken, Paarung, Aufzucht und Erziehung 22 regelt. Darüber hinaus tragen Veränderungen in Hypothalamus Entwicklung im späteren Leben Erkrankungen wie Übergewicht, Bluthochdruck, Diabetes und vorzeitige Pubertät 23 stammen. Die Möglichkeit, genetisch verändern die Hypothalamus während der Entwicklung würde ein sehr mächtiges Werkzeug, um es zu verstehen. Die grundlegende chirurgische Protokoll für die Laparotomie von schwangeren Mäusen, die wir verwenden hier ist ähnlich wie in anderen Protokollen 11,13,14,24 verwendet. Wir werden sie hier kurz beschreiben auf Vollständigkeit. Der Schlüssel zu unserem Verfahren, auf der anderen Seite, sind die Art der Anästhesie, der Ort der Injektion, die Art der Elektroden und das Einsetzen und Position der positiven Elektrode in bezug auf die Embryos Kopf. Wir bevorzugen zu induzieren und Aufrechterhaltung einer Narkose durch Einatmen Gas über einfache intraperitoneale Anästhesie, seit der ehemalige ermöglicht dieetwas längere Narkose für eine schwierige Operation erforderlich. Isofluran Einatmen führt zu einer schnelleren Erholung von der Narkose, da in der Regel die Mutter zeigt ein normales Verhalten bereits Minuten nach der Operation. Die einfachste Punkt der Injektion der DNA-Lösung mit dem Glas-Mikropipette ist die laterale Ventrikel, was jedoch völlig ungeeignet Hypothalamus Elektroporation. Injektion direkt in den dritten Ventrikel ist in der Tat wichtig, tief Zwischenhirn Strukturen zielen. Es ist möglich, den Hypothalamus von E12.0 oder E12.5 mit Standard-, off-the-shelf Elektroden transfektieren. Wir haben einige der Elektroden durch Nepa Gene (Chiba, Japan) besonders zu diesem Zweck geeignet hergestellt gefunden. Mit unserem Verfahren erhalten wir Transfektion des gesamten Hypothalamus Neuroepithel oder teilweise, je nach regionalen Transfektion Elektrode Orientierung. Hier zeigen wir die Technik, durch Transfektion der mammillary Körper, wohldie tiefste und Einbau aller Hypothalamus Kerne. Darüber hinaus zeigen wir detaillierte histologische Analyse der transfizierten Zellen auf der zellulären Ebene der Auflösung. Ein Vergleich der in utero Elektroporation mit anderen Ansätzen zur Transfektion der Maus entwickelnde Gehirn in utero kann in der Diskussion Abschnitt gefunden werden.

<table><tbody><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>REAGENTS</td></tr><tr><td>Acepromazine</td><td>Sanofi GmbH</td><td></td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Baxter</td><td>HDG9623</td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Pharma GmbH</td><td></td><td>Anästhetikum</td></tr><tr><td>Fast Green</td><td>Fluka</td><td>44715</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Rimadyl</td><td>Pfizer</td><td></td><td>nichtsteroidal entzündungshemmend</td></tr><tr><td>Braunoderm</td><td>Braun</td><td>3887138</td><td>Povidon-Jod-Phosphat-Puffer</td></tr><tr><td>Kochsalzlösung PBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Temgesic (Buprenorphin)</td><td>Essex Pharma</td><td></td><td>Opioid Analgetikum</td></tr><tr><td>Augensalbe</td><td>Pan-Ophtal</td><td>7136926</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>Bayer</td><td></td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td></td><td></td><td>EQUIPMENT</td></tr><tr><td>Anästhesiegerät Komesaroff Mark-5</td><td>Medical Developments Australien</td><td>ACN 004 903 682</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kapillarabzieher P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Compresstome</td><td>Precisionary Instr.</td><td>VF-300</td><td>Vibratom-Gerät</td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM700</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektroporator</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY21EDIT</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Elektrode 1</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY550-10</td><td>Nadelelektrode aus Edelstahl, 10 mm-Spitze, Ø 0,5 mm</td></tr><tr><td>Elektrode 2</td><td>Nepa Gene Co., Ltd.</td><td>CUY700P4L</td><td>Abdeckung Runde Platinplatte mit 4 mm Durchmesser</td></tr><tr><td>Faseroptische Kaltlichtquelle</td><td>Leica</td><td>KL2500 LCD&</td><td>nbsp;</td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>Harvard Apparatur</td><td>GC120T-15</td><td>1,2 mm Außendurchmesser x 0,94 mm Innendurchmesser</td></tr><tr><td>Glasperlen-Sterilisator</td><td>Fine Science Tools</td><td>FST250</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Harvard Apparatus</td><td>py872-5272</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Einspritzvorrichtung</td><td>World Precision Instruments</td><td>Pneumatische Pico-Pumpe PV820</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nahtfaden beschichtet Vicryl</td><td>Ethicon</td><td>V4914</td><td>Peritonealnaht</td></tr><tr><td>Thr. Supramid</td><td>Serag Wiessner</td><td>TO07171L</td><td>Hautnaht</td></tr></tbody></table>

genetische manipulation der maus entwickeln hypothalamus durch<em&gt; in utero</em&gt; elektroporation

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetische Modifikation von bestimmten Regionen des sich entwickelnden Gehirn von Säugetieren ist ein sehr mächtiges experimentellen Ansatz. Die Erzeugung neuartiger Mausmutanten ist oft frustrierend langsam. Es wurde gezeigt, dass der Zugang zum Gehirn der Maus zu entwickeln in der Gebärmutter mit hinreichender Post-OP-Überleben möglich ist. Dennoch Ergebnisse mit diesem Verfahren wurden fast ausschließlich für die meisten oberflächlich und leicht zugänglichen Teil des sich entwickelnden Gehirns gemeldet, dh die Rinde. Der Thalamus, ein schmaler und medialen Bereich, hat sich mehr schwer vorbei. Transfektion in tiefere Kerne, insbesondere diejenigen des Hypothalamus, ist vielleicht die größte Herausforderung und daher nur sehr wenige Ergebnisse gemeldet wurden. Hier zeigen wir ein Verfahren, um die gesamte Hypothalamus neuroepithelium oder ein Teil davon (Hypothalamus Regionen) für die Transfektion durch Elektroporation Ziel. Der Schlüssel zu unserem Ansatz sind länger Narkose mal, Injektion in den third Ventrikel und geeignete Art und die Positionierung der Elektroden. Darüber hinaus zeigen wir Ergebnisse von Targeting und anschließende histologische Analyse der meisten vertieften Hypothalamus Kern, die mammillary Körper.

Die meisten Hypothalamus Neuronen zwischen E11.5 bis E15.2 geboren, nach der Geburt-dating-Analyse bei der Ratte 26 in die etwas kürzer Mausentwicklung 27,28 übersetzt. Der Gipfel des Hypothalamus Neurogenese bei E12.5 29-31 erreicht. Demgemäß wird zum Transfektion Alter für die vorliegende Studie (E12.5) gewählt wird, kann ein großer Teil der hypothalamischen Neuronen zu einem bestimmten rostro-kaudalen Niveau bezeichnet werden. Analyse bei E18.5 auf dicken ...

Trotz der funktionalen und medizinische Bedeutung des Hypothalamus,<em&gt; In utero</em&gt; Genetische Manipulation seiner Entwicklung hat selten versucht worden. Wir zeigen ein detailliertes Verfahren für<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation in die Maus Hypothalamus und zeigen repräsentative Ergebnisse der vollständigen und teilweisen (regionalen) Hypothalamus Transfektion.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Plasmadesoxyribonukleinsäure (DNA) in den Hypothalamus von in der Gebärmutter sich entwickelnden Mausembryonen einzuschleusen, um die Funktion eines Zielgens zu aktivieren oder zu unterdrücken. Dies wird erreicht, indem zunächst die trächtige Maus anästhesiert und der Uterus durch eine Laparotomie freigelegt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die DNA-Lösung in das dritte Ventrikel des embryonalen Gehirns zu injizieren.Danach wird die positive Elektrode zwischen Plazenta und embryonalem Kopf innerhalb der Gebärmutter positioniert. Die negative Elektrode wird auf der äußeren Gebärmutteroberfläche platziert und elektrische Impulse werden appliziert. Der letzte Schritt besteht darin, die transfizierten embryonalen Gehirne sechs Tage später zu entnehmen.Schließlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die phänotypischen Veränderungen der transfizierten Zellen, deren Anzahl, Form, Position, Markerexpression usw. zu analysieren. Die Hauptvorteile dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der viralen Transfektion sind erstens, dass keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen erforderlich sind, und zweitens, dass eine geziel

genetic-manipulation-mouse-developing-hypothalamus-through-utero

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

In Utero intraventrikuläre Injektion und Elektroporation von E15 muriner Embryonen

In utero Elektroporation ermöglicht eine schnelle Gentransfer in eine räumlich-und zeitlich kontrollierten Art und Weise in den Entwicklungsländern das zentrale Nervensystem (ZNS). Hier beschreiben wir eine sehr anpassungsfähig in utero Elektroporation Protokoll, mit dem Ausdruck Konstrukte in mehreren embryonalen ZNS-Domänen, einschließlich der Telencephalon, Diencephalon und der Netzhaut liefern können.

Effiziente Gene Lieferung in mehrere ZNS Territories mit In Utero Elektroporation

Ein Gentransfer-Methode in den Entwicklungsländern Gehirn der Maus ist mit einer einzigartigen chirurgischen Verfahren und spezielle Form der Elektroden beschrieben. Diese einzigartige Technik erlaubt die Transfektion von Plasmid-DNA zeitlich und räumlich, was viele Neurowissenschaftler in das Studium der Entwicklung des Gehirns wird die Beihilfe.

Maus in Utero Elektroporation: Kontrollierte Spatiotemporal Gene Transefection

Diese Studie beschreibt die Entwicklung...

In-vitro-Elektroporation von der Unteren Rhombischer Lip von der Schwangerschaft ab muriner Embryonen

Dieser Artikel beschreibt im Detail, ein Protokoll zur in utero elektroporieren die Hirnrinde und im Hippocampus bei E14.5 bei Mäusen. Wir zeigen auch, dass dies eine wertvolle Methode, um Dendriten und Dornen in diesen beiden Hirnregionen zu untersuchen ist.

Visualisierung und genetische Manipulation von Dendriten und Dornen in der Maus Hirnrinde und im Hippocampus mit<em&gt; In utero</em&gt; Die Elektroporation

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das ein Werkzeug zur Untersuchung der Regulationsmechanismen bestimmter Gene während der Hippocampus-Entwicklung bietet. Der Einsatz von Ex-utero-Elektroporation und organotypischer Schnittkultur ermöglicht die Hoch- und Herunterregulierung der Expression von Genen von Interesse in einzelnen Zellen und die Verfolgung ihres Schicksals während der Entwicklung.

Ex Utero Elektroporation und Organotypischen Kultur der Maus Hippocampus-Gewebe

Dieses Protokoll beschreibt im Detail, wie verschiedene Regionen im Zentralnervensystem C57BL/6 mittels in utero-Elektroporation spezifisch transfiziert werden. In diesem Protokoll sind detaillierte Anweisungen für Transfektionen von Regionen enthalten, die sich zum Kortex, Hippocampus, Thalamus, Hypothalamus, Nucleus lateralis septum lateralis und Striatum entwickeln.

Cortex, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus, Lateral Septal Nucleus- und Striatum spezifische<em&gt; In Utero</em&gt; Electroporation in der C57BL / 6-Maus,

Periventrikulären noduläre Heterotopie (PNH) ist die häufigste Form der Fehlbildung der kortikalen Entwicklung (MCD) im Erwachsenenalter, aber seine genetische Basis bleibt bei den sporadischen Fällen unbekannt. Vor kurzem haben wir eine Strategie, um neue Kandidatengene für MCDs zu identifizieren und direkt ihre ursächliche Rolle in Vivobestätigen.

Eine neuartige Strategie verbindet Array-CGH, ganze Exome Sequenzierung und In Utero Elektroporation bei Nagetieren verursachenden Gene für Hirnfehlbildungen identifizieren

Die Rolle der kürzlich entdeckten krankheitsassoziierten Gene bei der Pathogenese neuropsychiatrischer Störungen bleibt unklar. Eine modifizierte bilaterale in utero Elektroporation Technik ermöglicht den Gentransfer in großen Populationen von Neuronen und Untersuchung der ursächlichen Auswirkungen von Genexpressionsänderungen auf das Sozialverhalten.

Eine Pipeline mit bilateraler Utero-Elektroporation zur Vernehmung genetischer Einflüsse auf das Nagetierverhalten

In diesem Protokoll beschreiben wir, wie die Amnionhöhle der Maus bei E7.5 mit Lentivirus injiziert wird, was zu einer gleichmäßigen Transduktion der gesamten Neuralplatte führt, mit minimalen nachteiligen Auswirkungen auf das Überleben oder die Embryonalentwicklung.

Murine Neural Plate Targeting by In Utero Nano-Injection (NEPTUNE) at Embryonic Day 7.5

Lernen Sie die In-utero-Elektroporation zur genetischen Manipulation des Hypothalamus bei Maus-Embryonen. Diese Methode ermöglicht die Transfektion von DNA in das dritte Ventrikel zur Untersuchung hypothalamischer Entwicklung.

Genetische Manipulation der Maus entwickeln Hypothalamus durch

Weitere Videos entdecken