4D التصوير التجميع البروتين في الخلايا الحية

يكتسب هذا النظام التجريبي صورا مضان ثلاثية الأبعاد عالية الدقة في الخلايا الحية لمراقبة وفحص الديناميكيات الزمانية المكانية لمراقبة جودة طي البروتين. أولا ، قم بإعداد الخلايا لدراسة مجمعات البروتين سريعة الحركة. احصل على مجموعة Z من الصور بدقة Z عالية.

ثم احصل على سلسلة زمنية مكونة من Zacks بعد ذلك ، وقم بعرض الصور الناتجة في فيلم ثلاثي الأبعاد وقم بتحليل الصور الناتجة. في النهاية ، يتيح التصوير الرباعي D تتبع الظواهر الديناميكية والعابرة في الخلايا في ظروف مختلفة. الميزة الرئيسية للتصوير الرباعي D على الطرق الحالية مثل الفحص المجهري واسع المجال والفاصل الزمني هي أنه يسمح لنا بتصور الديناميكيات والتوزيع الزمني المكاني لجميع مجموعات البروتينات في الخلية بدقة عالية.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية لتجميع البروتين ومراقبة الجودة وطي البروتين. هذه عمليات ديناميكية وعابرة للغاية. ومن ثم ، بدون دقة زمنية ومكانية عالية ، سيكون من المستحيل ملاحظة العديد منها.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لمراقبة جودة التجميع. يمكن أن يحدث أيضا ثورة في دراسة تفاعل البروتين وديناميكياته. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن أخذ أفلام ثلاثية الأبعاد من البروتينات ذات العلامات الداخلية أو منخفضة التعبير تتطلب استقرار النظام.

حساسية عالية وتبييض ضوئي منخفض قم بتحويل سلالات الخميرة ببلازميد تعبير لبروتين اندماج الفلور المرتبط ببروتين مستشعر طي العصارة الخلوية ، مثل الطفرة الحساسة لدرجة الحرارة في UBC تسعة. قم بزراعة الخميرة في وسائط اصطناعية تحتوي على 2٪ رافينوز لمدة 24 ساعة ، ثم قم بتخفيفها مرة أخرى إلى 2٪ من الوسائط المحتوية على Galactose لتخفيف سلالة الاستعلام إلى OD 600 بحوالي 0.2 والثقافة لمدة أربع إلى ست ساعات حتى تصل الثقافة إلى OD 600 بين 0.8 و 1.0 قبل 30 دقيقة من التصوير. قمع التعبير بوسائط اصطناعية مكملة بنسبة 2٪ جلوكوز.

تسمح هذه الخطوة بمراقبة التجمع المترجم والمطوي بالفعل للبروتين السريع. الآن صدمة حرارية للخلايا لمدة 20 دقيقة عند 37 درجة مئوية. للحث على سوء الطي ، حدد لوحة مناسبة للحفاظ على التركيز أثناء اكتساب D.Imaging الأربعة.

قم بتغطية الجزء السفلي من الطبق مع 0.25 ملليغرام لكل مليلتر يخدع أ لمدة 10 دقائق. يتم استخدام Con A للصق الخلايا بالشريحة ، مما يتيح متابعة خلية واحدة بمرور الوقت. استنشق المخادع والسهم ، وجفف اللوحة في غطاء كيميائي.

ثم أضف 200 ميكرولتر من عينة الخميرة. احتضن لمدة 15 دقيقة لتمكين الخلايا من الالتصاق باللوحة. قم بإجراء ثلاث غسلات بالوسائط للحصول على طبقة واحدة من الخلايا لتصوير الخميرة.

استخدم مجهرا متحد البؤر مع بعض التعديلات غير القياسية كما هو مفصل في النص المصاحب. يستخدم نظام تصوير الخميرة هذا ما يصل إلى أربعة ليزر وما يصل إلى أربعة أنابيب مضاعفة للصور مزودة بمرشحات. يتم إجراء معظم التصوير لدينا باستخدام مجموعة المرشح الأخضر ل EGFP ومجموعة مرشح أحمر لطماطم الكرز و TD.

قم أيضا بتجهيز البؤر متحد البؤر بمرحلة pi nano pizo لنظام التركيز المثالي وكل من الماسحات الضوئية galvan O والرنين توازن نظام المجهر حتى يتم الوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة. قبل التصوير بناء على معامل الانكسار لوسط التصوير مقابل وسط العينة ، حدد الماء أو الزيت أو الهواء الموضوعي المناسب. اضبط طوق التصحيح وفقا لسمك اللوحة.

نظف الهدف باستخدام مناديل العدسة والإيثانول. قم أيضا بتنظيف الشريحة التي تحمل العينة. ضع اللوحة على حامل المسرح بإحكام وتحقق من ثبات حامل العينة لضمان الإعدادات الصحيحة لكل عينة.

اضبط طوق التصحيح أثناء استخدام حبات الفلورسنت لتصور وظيفة انتشار النقاط باستخدام منفذ العين. حدد موقع الخميرة واتجاهها. بعد ذلك ، قم بتشغيل ضوء الفلورسنت epi المطلوب وركز على الخلايا التي تعرض النمط الظاهري ذي الصلة.

ثم باستخدام حقل المشرق ، قم بتقييم صحة الخلية وقابليتها للحياة وفقا للشكل والملمس لتقييمات بقاء الخلية. تصور النواة باستخدام فلور فلورا طماطم TD مدمجة بإشارة SV 40 و LS. TFP هو ضعف حجم GFP.

نظرا لأنه أعلى من حد انتشار النواة ، فإنه يعمل بشكل جيد للغاية كعلامة نووية. قم بإثارة TFP باستخدام ليزر أخضر 4 88 نانومتر في وقت واحد مثل GFP ، ولكن اجمع الانبعاثات الخضراء والحمراء في اثنين من PMTs منفصلين للدقة الطيفية. لتقليل الضوضاء والتشبع ، اضبط قوة الليزر وقطر الثقب كما هو مفصل في المخطوطة المصاحبة.

إذا كانت قوة النباتات المختلفة تنبعث منها طول موجي متطابق ، فاستخدم ميزة الكاشف الطيفي ، والتي تتيح اختيار المرشحات الافتراضية للحصول على صور بفاصل زمني وفقا للتصميم التجريبي ، يوفر Misfolded Protein U BBC nine Ts نظاما نموذجيا لمتابعة مراقبة جودة التجميع عبر الزمان والمكان. في العصارة الخلوية عند درجة الحرارة المسموح بها ، يتم طي UBC nine Ts وتنتشر في النواة والعصارة الخلوية عند الطي الخاطئ الناجم عن الحرارة. يتشكل في البداية نقطة ركام العصارية الخلوية الصغيرة سريعة الانتشار والتي تتم معالجتها من أجل تحلل البروتيازومات.

عندما يتم تثبيط البروتيازوم جزئيا ، يتم تحويل هذه النقاط إلى شوائب غير مرغوب فيها وiPod على مدار ساعتين تقريبا. في ظل الظروف العادية ، يتم طي GFP UBC nine Ts أصلا ويتم توطينه بشكل منتشر في العصارة الخلوية للنواة كما هو موضح هنا باللون الأخضر. عند تحول درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية ، يتم طي بروتين الاندماج بشكل خاطئ ويشكل مجاميع النقاط العصارية الخلوية عند التعافي من الصدمة الحرارية عند 23 درجة مئوية.

يتم تحلل تسعة Ts G-F-P-U-B-C المشوهة حراريا كما هو موضح من خلال انخفاض مستوى التألق. يتم تصنيف النواة باللون الأحمر بواسطة N-L-S-T-F-P. عندما يقترن التحول في درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية بتثبيط البروتيازوم ، يتم طي G-F-P-U-B-C تسعة T بشكل خاطئ ومعالجتها في شوائب غير مرغوب فيها وأجهزة iPod.

هنا ، يتم التعبير عن بروتياز يوبيكويتين أربعة لمنع تثبيط كل مكان في كل مكان مع نتائج التحول في درجة الحرارة في معالجة G-F-P-U-B-C تسعة Ts في تضمين iPod. تصور صور الفاصل الزمني هذه التي تم الحصول عليها على فترات أربع دقائق بوضوح ديناميكيات تكوين البريد غير المرغوب فيه وآي بود. يمكن استخدام هذه التقنية لمراقبة البروتين الخلوي بمرور الوقت باستخدام UBC nine Ts كمستشعر قابل للطي.

يمكن أيضا إجراء التصوير رباعي الأبعاد في أنظمة نموذجية أخرى مثل خلايا الثدييات وأناقة C. يسمح التصوير رباعي الأبعاد أيضا بإلقاء نظرة ثاقبة على الأحداث الدقيقة الأخرى في مراقبة جودة التجميع ، مثل تكوين وديناميكيات بؤر الإجهاد الكلي القابلة للذوبان ، وتسليم الركام إلى مقصورات البريد غير الهام وأجهزة iPod.